Name: Visualisation du gardien : l’évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par un colorant bleu d’Evan chez le poisson-zèbre adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Apprenez à évaluer l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique chez Danio rerio adulte par coloration au bleu d'Evans. Cette méthode simple et reproductible permet une analyse qualitative et quantitative des altérations neurovasculaires.

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Ce protocole a été suivi et autorisé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université islamique internationale de Malaisie (IIUM), en référence à l’approbation de l’éthique animale (réf. n° : IIUM/504/14/2/IACUC).
1. Préparez la solution mère de colorant Evans Blue
<ol>
	<li>Dissoudre 0,1 g de colorant EB dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour préparer une solution mère à 1 % (p/v). Mélangez soigneusement jusqu’à ce que le colorant soit complètement dissous. ATTENTION : L’EB est classé dans la catégorie cancérogène 1B. Évitez tout contact direct avec la peau et les yeux. Utilisez des vêtements de protection, des gants, des lunettes de sécurité et un respirateur anti-poussière. Évitez d’inhaler de la poussière et suivez les instructions de manipulation du fabricant. Ne jetez pas le colorant Evans Blue (solide ou en solution) dans l’évier. Conservez les déchets dans les contenants d’origine étiquetés. Éliminez conformément aux réglementations nationales et locales en matière de déchets dangereux.</li>
	<li>Filtrez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm. Prélever le filtrat dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et conservez-le à 4 °C. REMARQUE : Un filtre de taille de pores plus petit (par exemple, 0,2 μm) peut également être utilisé. La solution mère peut être conservée à 4 °C jusqu’à deux semaines, ou à -20 °C jusqu’à un mois, l’aliquotage étant recommandé pour minimiser les cycles répétés de congélation-décongélation lorsqu’il est stocké congelé.</li>
</ol>
2. Administrer le colorant Evans Blue au poisson-zèbre adulte
<ol>
	<li>Anesthésier le poisson-zèbre par choc hypothermique en abaissant progressivement la température de l’eau de 12 °C à 7 °C, jusqu’à ce que le poisson ne réponde plus aux stimuli tactiles. REMARQUE : Une réduction progressive de la température peut être obtenue en ajoutant lentement de petites quantités de glace pilée à l’eau pendant plusieurs minutes, permettant à la température de diminuer progressivement. L’immersion dans la tricaïne est également une méthode d’anesthésie alternative appropriée.</li>
	<li>Injecter 20 μL de colorant EB à 1 % dans la cavité intrapéritonéale (IP) à l’aide d’une seringue à insuline de 31 G. Appliquez une légère pression sur le site d’injection pendant 10 s pour éviter le reflux. REMARQUE : La cavité intrapéritonéale du poisson-zèbre est située à l’arrière de la ceinture pelvienne. Pour augmenter le taux de réussite de l’administration d’EB, faites jeûner le poisson pendant 24 heures avant l’injection. Cela permettra de vider la cavité abdominale pour offrir un meilleur accès et une meilleure précision à l’espace intrapéritonéal.</li>
	<li>Transférez les poissons dans un réservoir de récupération et laissez la récupération pendant 30 min. Surveiller l’apparition de blessures, de décès ou de changements de comportement. REMARQUE : Pour aider le poisson-zèbre à récupérer, utilisez une température de l’eau légèrement réduite (20-24 °C) pour le réservoir de récupération afin de fournir un effet anesthésique léger et d’aider à engourdir l’inconfort post-injection potentiel. Les poissons injectés présenteront une teinte bleue, indiquant une circulation réussie du colorant (figure 1).</li>
	<li>Après 30 min, euthanasier le poisson par choc hypothermique à 1 °C à 3 °C. Ensuite, décapitez le poisson à l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux chirurgicaux. REMARQUE : Pour aider à la dissection du cerveau plus tard, laissez de la chair supplémentaire derrière la tête lors de la décapitation.</li>
	<li>Rincez la tête deux fois avec 1x PBS (rapport poisson/PBS de 1:20) pour éliminer l’excès de sang et de colorant EB. REMARQUE : Un lavage insuffisant peut entraîner des résultats faussement positifs et compromettre la précision de l’analyse. Pour éviter cela, lavez soigneusement le tissu cérébral au moins deux fois avec 1x PBS, en veillant à ce que tout le sang visible et le colorant qui s’écoule librement soient éliminés. S’il reste un colorant résiduel, un troisième lavage est fortement recommandé.</li>
	<li>Fixer la tête dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 °C pendant la nuit (rapport poisson/fixateur de 1:20). L’agitation n’est pas nécessaire pendant la fixation, car la petite taille de la tête du poisson-zèbre et le volume de fixateur suffisant permettent une pénétration efficace dans des conditions statiques. ATTENTION : Le PFA est nocif en cas d’ingestion, d’inhalation ou de contact avec la peau. Préparez la solution de PFA sous une hotte. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et évitez d’inhaler de la poussière. Suivez toutes les directives de sécurité du fabricant. Traiter les PFA comme des déchets dangereux. Évitez de le jeter dans les égouts. Collectez et étiquetez les déchets dans des conteneurs scellés et éliminez-les conformément aux réglementations locales et nationales.</li>
	<li>Disséquer le cerveau du poisson-zèbre<ol>
		<li>Placez la tête fixe dans une boîte de Pétri propre et disséquez le cerveau comme décrit précédemment15, à l’aide d’une pince à épiler à bout pointu. Ajouter continuellement 1x PBS dropwise pendant la dissection pour garder le tissu hydraté et prévenir le dessèchement.</li>
		<li>Préparez la plaque d’agarose en dissolvant 1 g d’agarose dans 100 mL d’eau distillée. Passez-le au micro-ondes jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu, versez-le dans une boîte de Pétri et laissez-le se solidifier.</li>
		<li>Rincez le cerveau disséqué deux fois dans deux bains séparés 1x PBS. Ensuite, placez le tissu sur une plaque d’agarose à 1 % pour retenir l’humidité et éviter le rétrécissement. REMARQUE : Un lavage insuffisant peut entraîner des résultats faussement positifs et compromettre la précision de l’analyse. Pour éviter cela, lavez soigneusement le tissu cérébral au moins deux fois avec 1× PBS, en vous assurant que tout le sang visible et le colorant qui s’écoule sont éliminés. S’il reste un colorant résiduel, un troisième lavage est fortement recommandé.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69010/69010fig1.jpg"> 
Figure 1 : Comparaison de la coloration de la peau entre un poisson-zèbre normal et un poisson-zèbre injecté d’EB. (A) Poisson zèbre normal présentant un teint brunâtre typique. (B) Poisson-zèbre injecté d’EB présentant une teinte bleuâtre notable, indiquant une circulation systémique réussie du colorant. Barre d’échelle = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69010/69010fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Établir un contrôle positif par blessure par arme blanche (SWI)
REMARQUE : La blessure par arme blanche brise la BHE et permet l’extravasation de l’EB au site de la blessure.
<ol>
	<li>Anesthésier le poisson à l’aide de la méthode du choc hypothermique (voir étape 2.1). Une fois anesthésié, injecter 20 μL de colorant EB à 1 % et laisser le poisson récupérer pendant 30 minutes comme décrit aux étapes 2.2 et 2.3.</li>
	<li>Après une période de récupération de 30 minutes, préparez une aiguille stérile de 31 G attachée à une seringue à insuline et effectuez une procédure de blessure à l’arme blanche comme suit :<ol>
		<li>Anesthésier à nouveau le poisson.</li>
		<li>Placez le poisson à la verticale sur une surface plane et froide (p. ex. un sac de glace). Insérez l’aiguille dans un côté du télencéphale à un angle de 90° jusqu’à une profondeur ne dépassant pas 1,5 mm (Figure 2). REMARQUE : Pour éviter tout contact direct de la peau avec le sac de glace et éviter d’endommager la peau, placez une couche de gaze ou d’essuie-tout entre le poisson et la surface froide (figure 2). Alternativement, le poisson peut être placé dans une boîte de Pétri peu profonde placée sur le dessus de la compresse froide pour maintenir le refroidissement sans contact direct. Marquez 1,5 mm sur l’aiguille pour éviter une pénétration excessive.</li>
		<li>Transférez le poisson dans un réservoir de récupération et laissez récupérer pendant 30 min.</li>
		<li>Euthanasier, décapiter, réparer et disséquer le cerveau comme décrit aux étapes 2.4 à 2.7.</li>
		<li>Pour un contrôle négatif, répétez les étapes 2.1 à 2.7 en utilisant 20 μL de 1x PBS au lieu du colorant EB.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69010/69010fig2.jpg"> 
Figure 2 : Blessure par arme blanche pour un contrôle positif. (A) Insérez brièvement une aiguille 31G dans le télencéphale (cercle rouge) pour faciliter la pénétration du colorant EB dans le tissu cérébral ; Comparaison côte à côte d’un cerveau non blessé et d’un cerveau poignardé, (B) vue dorsale du site du coup de couteau (cercle rouge), (C) vue latérale du site du coup de couteau. Barre d’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69010/69010fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
4. Analyse qualitative de l’extravasation de l’EB
<ol>
	<li>Observez des tissus cérébraux disséqués au microscope. Optimisez les paramètres de l’image (zoom, balance des blancs, exposition, contraste, etc.) pour assurer la cohérence.</li>
	<li>Capturez des images à l’aide d’une caméra montée sur microscope et enregistrez-les au format . format TIFF. REMARQUE : Utilisez des paramètres d’imagerie identiques pour tous les échantillons afin de garantir une validité comparative.</li>
</ol>
5. Analyse quantitative de l’extravasation de l’EB
<ol>
	<li>Téléchargez et installez Fidji (un lien pour télécharger le logiciel est disponible dans la table des matériaux). Ouvrez l’image aux Fidji.</li>
	<li>Effectuez la déconvolution des couleurs en cliquant sur : Image &gt; Couleur &gt; Déconvolution des couleurs &gt; RVB, ce qui donne trois images distinctes représentant les teintes rouge, verte et bleue. REMARQUE : Cette étape permet d’isoler la teinte bleue des autres composants de la couleur, en s’assurant que seule l’intensité du colorant bleu est mesurée.</li>
	<li>Activez l’image du canal bleu (généralement étiquetée « Color_3 ») en cliquant sur l’image. Convertissez-le en niveaux de gris 8 bits en cliquant sur : Image &gt; Type &gt; 8 bits. REMARQUE : La conversion en niveaux de gris minimise les artefacts de couleur et améliore l’analyse basée sur l’intensité.</li>
	<li>Mesurez l’intensité du gris de l’image 8 bits.<ol>
		<li>Réglez les mesures en sélectionnant : Analyser &gt; Définir les mesures ; sélectionnez Zone et Valeur de gris moyenne.</li>
		<li>À l’aide de l’outil de sélection de rectangle, dessinez une région d’intérêt (ROI) de taille uniforme et mesurez l’intensité du gris en sélectionnant Analyser &gt; mesure ou en appuyant sur Ctrl + M. REMARQUE : La même taille de retour sur investissement doit être utilisée pour tous les échantillons. Les dimensions absolues du retour sur investissement peuvent varier en fonction du grossissement et de la résolution de l’image acquise, de sorte que les chercheurs doivent normaliser la taille du retour sur investissement dans leur ensemble de données pour assurer la comparabilité. Chaque pixel de l’image en niveaux de gris 8 bits a une valeur d’intensité comprise entre 0 et 255, où 0 représente le noir pur, 255 représente le blanc pur et les valeurs intermédiaires représentent différentes nuances de gris.</li>
		<li>Pour réduire les biais, dessinez trois à cinq zones d’intérêt dans des régions anatomiquement cohérentes du cerveau sur tous les échantillons. Évitez les régions avec des artefacts ou des taches incohérentes. REMARQUE : La cohérence du placement peut être obtenue en se référant à des repères anatomiques et en s’assurant que le positionnement du retour sur investissement est symétrique entre les groupes expérimentaux.</li>
		<li>Faites la moyenne des valeurs moyennes de gris des ROI pour chaque image afin d’obtenir une seule valeur d’intensité par cerveau. Utilisez cette moyenne pour la comparaison statistique entre les groupes.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-brain+barrier+overview+on+structure%2C+function%2C+impairment%2C+and+biomarkers+of+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 1-24 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Poudre d’agarose</td><td>Vivantis</td><td>Réf. PC0701</td><td></td></tr><tr><td>Teinture bleue d’Evan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fidji ImageJ</td><td>Instituts nationaux de la santé, États-Unis</td><td></td><td>Lien pour télécharger : https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Caméra microscope</td><td>ShenZhen Hayear Electronics Co., Ltd.</td><td>HY-500M</td><td></td></tr><tr><td>Poudre de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. P4417</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Produits chimiques HmbG</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtre à seringue, 0,45&micro ; m</td><td>Merck Millipore&nbsp ;</td><td>SLHV004SL</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation du gardien : l’évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par un colorant bleu d’evan chez le poisson-zèbre adulte

Visualizing the Gatekeeper: Evan's Blue Dye-Based Assessment of Blood-Brain Barrier Permeability in Adult Zebrafish

Ce protocole a été testé sur un modèle de poisson-zèbre parkinsonien. La compromission de la BHE est un phénomène bien documenté chez les patients atteints de la MP 16,17,18 et chez divers modèles animaux parkinsoniens 19,20,21. Pour étudier l’intégrité de la BHE dans le modèle parkinsonien adulte de poisson-zèbre, l’extravasation du co...

Visualisation du gardien : l’évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par un colorant bleu d’Evan chez le poisson-zèbre adulte

The Blood-Brain Barrier (BBB) is a semi-permeable interface that maintains central nervous system (CNS) homeostasis by regulating the movement of ...

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Nous décrivons une mesure animal vivant ensemble quantitative de la perméabilité du cerveau du poisson zèbre embryonnaire. La technique analyse la capacité à retenir le liquide céphalorachidien et les molécules de poids moléculaires différents dans la lumière du tube neural et quantifie leur mouvement hors des ventricules. Cette méthode est utile pour déterminer les différences de perméabilité épithéliale et la maturation au cours du développement et de la maladie.

Un test de perméabilité du neuro-épithélium embryonnaire poisson zèbre

Nous présentons une nouvelle méthode de gavage microscopique de larves de poisson-zèbre utilisant du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de microscopie stéréo. Nous démontrons que le gavage microscopique est une technique sûre et efficace, utile pour délivrer des quantités contrôlées de divers matériaux directement dans la lumière intestinale des larves de poisson-zèbre.

Microgavage de larves de poisson zèbre

Cette vidéo présente une procédure d’évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin EAE. Des colorants fluorescents de différentes tailles sont injectés rétro-orbitaire et circulent dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Le plus petit colorant s’échappe par des interstices dans le tissu cérébral, tandis que le plus grand colorant n’y pénètre que si la perturbation est grave, en corrélation avec l’étendue des dommages à la barrière.

Détermination de la rupture de la barrière hémato-encéphalique à l’aide de colorants fluorescents dans un modèle murin EAE

Rupture de la barrière hémato-encéphalique facilite la prestation de certains médicaments vers le cerveau. Mannitol livré intra-artérielle se rétrécit cellules entourant les vaisseaux sanguins afin de perturber physiquement la barrière.

Modèle Rat de rupture de la barrière hémato-encéphalique pour permettre ciblée Therapeutics neurovasculaire

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d'un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L'expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l'inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.

Un test In Vivo barrière hémato - encéphalique perméabilité chez la souris à l’aide de fluorescent marqué traceurs

L'intégrité de la barrière hémato-encéphalique est essentielle à la fonction du système nerveux. Dans Drosophila melanogaster, la barrière hémato-encéphalique est formée par les cellules gliales au cours de l'embryogenèse tardive. Ce protocole décrit les méthodes à essayer pour la formation et l'entretien de barrière hémato-encéphalique dans les embryons de D. melanogaster et les larves de troisième instar.

Analyse de l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le mélanogaster Drosophila

Nous présentons ici une méthode pour imager le cerveau embryonnaire du poisson-zèbre in vivo jusqu’aux stades larvaire et juvénile. Cette procédure micro-invasive, adaptée des approches électrophysiologiques, donne accès aux détails cellulaires et subcellulaires des neurones matures et peut être combinée avec des études optogénétiques et neuropharmacologiques pour caractériser la fonction cérébrale et l’intervention médicamenteuse.

Imagerie in vivo de tissu cérébral entièrement actif chez des larves et des juvéniles de poissons-zèbres éveillés par enlèvement du crâne et de la peau

Ce protocole démontre la micro-injection de lipopolysaccharide dans la région ventriculaire du cerveau dans un modèle larvaire de poisson zèbre pour étudier la réponse neuroinflammatoire et la neurotoxicité qui en résultent.

Microinjections ventriculaires cérébrales de lipopolysaccharide dans des larves de poisson-zèbre pour évaluer la neuroinflammation et la neurotoxicité

Un protocole est présenté pour évaluer si les petits VE (sEVs) isolés à partir d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques (modélisation d’un aspect de la prééclampsie) perturbent la barrière hémato-encéphalique chez les souris femelles adultes non gravides.

Perturbation de la barrière hémato-encéphalique de la souris par de petites vésicules extracellulaires provenant de placentas humains hypoxiques

Une méthode a été mise au point pour visualiser l’extravasation du colorant due à la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) en administrant deux colorants fluorescents à des souris à différents moments dans le temps. L’utilisation du glycérol comme cryoprotecteur a facilité l’immunohistochimie sur le même échantillon.

Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère

Apprenez à évaluer l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique chez Danio rerio adulte par coloration au bleu d'Evans. Cette méthode simple et reproductible permet une analyse qualitative et quantitative des altérations neurovasculaires.

Visualisation du gardien : l’évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par un colorant bleu d’Evan chez le poisson-zèbre adulte (Vidéo) | JoVE Journal

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