Visualisation du gardien : l’évaluation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par un colorant bleu d’Evan chez le poisson-zèbre adulte

Cette recherche se concentre sur le développement d’une méthode fiable, simple et rentable pour évaluer l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique chez le poisson-zèbre adulte. La plupart des études sur le poisson-zèbre n’ont pas de moyen simple et fiable de mesurer la perturbation de la barrière hémato-encéphalique, et les méthodes existantes sont souvent complexes ou coûteuses. Ce protocole offre donc une solution pratique et abordable.

Ce protocole est simple, rentable et combine à la fois des analyses visuelles et mesurables, le tout sans avoir besoin d’équipement coûteux ou d’étapes compliquées. En fournissant un protocole simple et reproductible, il sera plus facile pour les laboratoires d’explorer les changements neurovasculaires dans des modèles de maladies du poisson-zèbre adulte. Pour commencer, anesthésie le poisson-zèbre en abaissant progressivement la température de l’eau de 12 degrés Celsius à sept degrés Celsius jusqu’à ce que le poisson ne réponde plus aux stimuli tactiles.

À l’aide d’une seringue à insuline de calibre 31, injectez 20 microlitres de colorant Evans blue à 1 %, ou EB, dans la cavité intrapéritonéale du poisson et appliquez une légère pression au site d’injection pendant 10 secondes pour éviter le reflux. Transférez maintenant le poisson dans un réservoir de récupération et laissez la récupération pendant 30 minutes. Surveillez le poisson pour détecter les blessures, la mortalité ou les changements de comportement pendant cette période.

Pour établir un contrôle positif, préparez une aiguille stérile de calibre 31 attachée à une seringue à insuline pour effectuer une procédure de blessure par arme blanche. Après une période de récupération de 30 minutes, anesthésez à nouveau le poisson, comme démontré précédemment. Placez le poisson à la verticale sur une surface plane et froide, comme un sac de glace.

Insérez l’aiguille dans un côté du céphalon à un angle de 90 degrés jusqu’à une profondeur ne dépassant pas 1,5 millimètre. Transférez ensuite le poisson dans un réservoir de récupération et laissez-le récupérer pendant 30 minutes. Après avoir euthanasié le poisson par hypothermie, utilisez une lame stérile ou des ciseaux chirurgicaux pour décapiter le poisson euthanasié.

Rincez la tête deux fois dans 1X PBS en utilisant un rapport de 1:20 de poisson sur PBS pour éliminer l’excès de sang et de colorant bleu Evans. Fixez ensuite la tête dans du paraformaldéhyde à 4 % en utilisant un rapport de 1:20 entre le poisson et le fixateur, et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Placez la tête fixe dans une boîte de Pétri propre et disséquez le cerveau à l’aide d’une pince à épiler à bout pointu.

Ajoutez continuellement du PBS goutte à goutte pendant la dissection pour garder le tissu hydraté et prévenir le dessèchement. Rincez le cerveau disséqué deux fois dans deux bains PBS distincts et placez le tissu sur une plaque d’agarose à 1 % pour retenir l’humidité et éviter le rétrécissement. Observez les tissus cérébraux disséqués au microscope stéréoscopique.

Pour commencer l’analyse quantitative, téléchargez et installez le logiciel Fidji et ouvrez le fichier d’image cérébrale dans Fidji. Effectuez la déconvolution des couleurs en sélectionnant Image, puis Couleur, Déconvolution des couleurs, puis RVB. Cela se traduira par trois images distinctes représentant des teintes rouge, verte et bleue.

Maintenant, activez l’image du canal bleu, généralement étiqueté Couleur 3, en cliquant sur l’image. Convertissez-le en niveaux de gris 8 bits en sélectionnant Image, suivi de Type et 8 bits. Ensuite, pour mesurer l’intensité du gris de l’image 8 bits, définissez les paramètres de mesure en sélectionnant Analyser et Définir les mesures.

Choisissez ensuite la zone et la valeur de gris moyenne. À l’aide de l’outil de sélection de rectangle, dessinez une région d’intérêt de taille uniforme et mesurez l’intensité du gris en sélectionnant Analyser, puis Mesurer. Le poisson-zèbre normal présentait un teint brunâtre typique, et le poisson-zèbre injecté d’EB présentait une teinte bleuâtre notable.

Pour étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans le modèle parkinsonien adulte de poisson-zèbre, l’extravasation du colorant EB dans les tissus cérébraux a été comparée entre le témoin injecté de solution saline et le poisson-zèbre parkinsonien. Dans le groupe témoin négatif, les vaisseaux sanguins du cerveau semblaient rougeâtres, indiquant l’absence d’extravasation du colorant EB. En revanche, les groupes témoin injecté de solution saline, témoin positif et parkinsonien ont tous montré une coloration bleuâtre dans le système vasculaire cérébral, confirmant la circulation systémique réussie du colorant EB.

Les cerveaux disséqués du groupe témoin négatif semblaient blanchâtres avec des vaisseaux sanguins clairement visibles, confirmant l’absence de coloration EB. Dans le groupe témoin positif, une coloration bleue intense entourant le tissu cérébral indiquait une fuite de colorant due à une rupture délibérée de la barrière hémato-encéphalique. Dans le groupe injecté de solution saline, la coloration de l’EB est restée confinée aux vaisseaux sanguins, indiquant une barrière hémato-encéphalique intacte.

Le groupe parkinsonien a montré un motif de coloration bleue plus foncé et plus diffus, indiquant une fuite significative de colorant EB et une compromission de la barrière hémato-encéphalique. L’analyse quantitative des niveaux de gris a révélé des valeurs d’intensité de gris significativement plus faibles dans le groupe parkinsonien par rapport au groupe injecté de solution saline.