Mutagénèse précise des phages avec des systèmes CRISPR-Cas assistés par NgTET

Nous étudions l’infection par les phages au niveau moléculaire. C’est vraiment de la science fondamentale. Cependant, nous ne faisons pas seulement de la science fondamentale, nous sommes également désireux de traduire cette science fondamentale en applications où nous utilisons ces connaissances pour étudier l’infection par les phages, et pour les utiliser pour l’ingénierie des phages, et pour des applications thérapeutiques.

L’un des développements les plus récents dans le domaine de la recherche sur les phages est la découverte d’un système immunitaire bactérien. Ce système immunitaire est présent dans toutes les bactéries et elles ont identifié ou généré des outils pour vraiment lutter contre le phage. Cependant, le phage est assez intelligent.

Un phage a également été capable d’identifier des outils et de développer des outils qui lui permettent d’échapper à ces systèmes immunitaires. Et l’un d’entre eux est en fait la modification de son ADN par modification. Et c’est surtout intéressant pour nous, vraiment intéressant parce que l’étude de la nature chimique de ces modifications de l’ADN que les phages ont générées pour échapper aux systèmes immunitaires est vraiment intéressante, et nous permet également de devenir un outil pour concevoir le phage à la fin.

Au cours des 10 dernières années, d’excellentes technologies ont été développées par d’excellents collègues du monde entier. L’une de ces technologies est, par exemple, le séquençage de nouvelle génération. Sur la base de cette technologie, nous pouvons vraiment séquencer les phages, mais aussi l’ensemble des génomes de l’hôte au niveau moléculaire.

D’autre part, la spectrométrie de masse, quelque chose comme la protéomique, a été développée. CRISPR est un outil merveilleux qui est maintenant appliqué dans divers règnes de la vie. Et nous l’utilisons maintenant pour modifier le génome du phage.

Ce ne sont là que quelques-unes des technologies merveilleuses qui ont remodelé notre façon de penser les phages aujourd’hui. Lorsque nous parlons des défis actuels, l’un des défis que nous voyons est l’ingénierie biologique CRISPR d’un génome de phage. Le génome du phage est totalement modifié avec des modifications de l’ADN, et les ACE nucléaires CRISPR ne sont en fait pas capables de cliver l’ADN.

C’est donc vraiment un défi que nous devons surmonter si nous voulons modifier les génomes des phages bactériens. Mon groupe a découvert un élément constitutif totalement nouveau des ARN. Nous avons découvert que des transcrits spécifiques portent à leur extrémité cinq principale, le spectre redox, le nicotinamide adénine dinucléotide court NAD, et nous l’avons également découvert récemment pour la première fois dans les interactions entre les phages E-coli T4.

Sur la base de cette découverte, nous avons également identifié que les ARN et les protéines peuvent interagir les uns avec les autres d’une manière totalement nouvelle. Nous avons découvert que ce NAD que j’ai décrit précédemment fonctionne comme une colle moléculaire pour lier les ARN et les protéines entre eux. Cette exaltation de l’ARN est une façon totalement nouvelle de la façon dont les ARN et les protéines interagissent les uns avec les autres dans la nature.

Et nous avons fait cette découverte dans l’interaction éco anti-phage. Nous sommes également désireux de traduire cette science fondamentale en applications, par exemple dans le domaine des thérapies à base d’ARN. Pour commencer, traitez 500 microlitres de suspension de phages avec 20 unités d’ADN 1.

Ajoutez deux microlitres d’ARN AT1 mélangés dans le tube. Incuber le mélange traité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, chargez 500 microlitres de la solution de phage traitée sur un gradient de saccharose préparé.

Centrifuger le gradient à 70 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Allumez le tube de centrifugation par le bas pour visualiser la bande de phage trouble dans le gradient. Ensuite, à l’aide d’une canule émoussée, retirez soigneusement la fraction contenant le phage dans un nouveau tube d’ultra-ultracentrifugation.

Maintenant, ajoutez 30 millilitres de tampon TM glacé dans le tube et la centrifugeuse. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon TM après avoir jeté le surnageant. Conservez les phages remis en suspension dans un flacon en verre à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Ajoutez un microgramme de protéinase K aux phages remis en suspension. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite un volume égal de mélange de phénol chloroforme et d’alcool isoamylique à l’échantillon.

Retournez pour bien mélanger et centrifugez. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube réactionnel et répétez l’extraction trois fois. Effectuez trois extractions de chloroforme en utilisant un volume égal de chloroforme pour éliminer le phénol résiduel.

Ensuite, précipitez l’ADN en ajoutant 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires à PH 5,5 et 2,5 volumes d’éthanol. Incuber le mélange toute la nuit à moins 20 degrés Celsius. Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 15 000 g pendant une heure à quatre degrés Celsius pour granuler l’ADN.

Lavez deux fois la pastille d’ADN avec 200 microlitres d’éthanol à 70 %. Secouez doucement le tube et centrifugez à nouveau. Retirez délicatement le surnageant.

Ensuite, suspendez l’ADN purifié dans de l’eau ultrapure. Conservez l’ADN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement. Inoculer des cellules d’Escherichia coli BL 21D 3 qui sont transformées à la fois avec le plasmide PET 28 NGTet et un plasmide d’expression CAS 12 ou CAS 9.

Cultivez la culture dans un milieu LB avec des antibiotiques appropriés à 37 degrés Celsius en secouant. Induire l’expression de NG TED en ajoutant 0,05 millimolaire d’IPTG et incuber pendant deux heures supplémentaires à 37 degrés Celsius. À titre de témoin, comparez les souches d’E. coli BL 21 D3 avec et sans surexpression de NgTET.

Transférez 300 microlitres de cultures d’E. coli dans un tube stérile. Infecter la culture avec un phage de type sauvage T4 ou traité au NgTET à une multiplicité d’infection de 0,01. Mélangez doucement pour assurer une distribution uniforme des phages puis incubez à nouveau.

Ajouter le mélange de phages de bactéries à quatre millilitres de tarière souple LB contenant 0,75 % de vis sans fin et d’antibiotiques. Mélangez soigneusement, mais doucement pour éviter la formation de bulles. Versez le mélange de vis sans fin molle sur une plaque de vis LB préchauffée.

Laissez la plaque se solidifier brièvement à température ambiante et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, comptez les plaques pour déterminer le nombre d’unités formant des plaques. Pour la sélection du compteur, infectez E.coli cast 13 A espaceur à l’aide des phages à sélectionner.

Effectuez la sélection du compteur dans les mêmes conditions que celles utilisées pour la mutagénèse. Après l’incubation, filtrez le SUP natant à travers un filtre de 0,45 micromètre pour éliminer les débris bactériens. Utilisez les phages sélectionnés au compteur et filtrés pour un test de plaque sur une souche d’E. coli B afin d’isoler des plaques individuelles pour une validation en aval.

La bande lysologique était clairement visible lorsque l’échantillon de phage T4 était suffisamment concentré. L’expression de la protéine NgTET dans E. coli a été confirmée par le phage SDS, montrant sa présence dans les fractions solubles et insolubles après lyse cellulaire et centrifugation. Les chromatogrammes ont montré que les abondances relatives de dioxiadénosine, de diiodohydroxyquinoléine et de thymidine étaient inchangées entre l’ADN du phage T4 de type sauvage et l’ADN du phage T4 traité au NgTET.

L’abondance des dérivés modifiés de cytosine a été considérablement réduite dans l’ADN de phage traité au NgTET par rapport à l’échantillon non traité. Un plasmide contenant le gène NgTET et des régions d’homologie pour la mutagenèse ciblée a été construit à l’aide du clonage Golden Gate. Le dépistage par PCR a confirmé l’amplification réussie du gène cible dans les couloirs deux à neuf du gel agros, indiquant des résultats positifs parmi les plaques cueillies.

Dans l’ADN des phages de type T4 sauvage, l’abondance relative de la 5 glycosylhydroxyéthyl 2 première désoxydine était élevée. Dans l’ADN du phage T4 traité au NgTET, les niveaux de 5 glycosylhydroxyéthyl 2 première désoxydine ont été fortement réduits par rapport au type sauvage. L’ADN du phage T4 traité avec le mutant catalytique inactif NgTET D234 A a conservé des niveaux élevés de 5 glycolhydroxyéthyl 2 prime désoxydine.

La descendance récupérée du phage T 4 a montré des niveaux presque restaurés de 5 hydroxyméthyl 2 prime désoxydine par rapport au type sauvage.