Name: Mutagénèse précise des phages avec des systèmes CRISPR-Cas assistés par NgTET (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez la mutagénèse CRISPR-Cas sans cicatrice des bactériophages assistée par l'enzyme NgTET. Cette méthode réduit les modifications de l'ADN viral pour améliorer l'ingénierie génétique et la thérapie phagique.

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<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
<li>Adler, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+CRISPR-Cas13a+enables+efficient+phage+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing.</a> Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).</li>
<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

Les bactériophages sont des virus qui ciblent spécifiquement les bactéries. Ils ont suscité un intérêt considérable pour la recherche en raison de leur immense potentiel en biotechnologie et en médecine, en particulier dans la lutte contreles bactéries multirésistantes 1,2,3. Malgré cela, la biologie des phages reste relativement peu étudiée. Une compréhension plus approfondie de leurs mécanismes moléculaires de détournement de leurs hôtes bactériens est essentielle pour exploiter pleinement leur potentiel thérapeutique et biotechnologique4. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’infection efficace par les phages et pour concevoir les phages pour des applications spécifiques, la capacité de modifier génétiquement les génomes des phages est essentielle. Pourtant, il reste l’un des défis les plus importants dans le domaine de la biologie des phages 3,5,6.
L’ADN des phages est souvent modifié par des altérations chimiques spécifiques des bases puriques et pyrimidines, par exemple, la glycosylation et la méthylation de la cytosine. Ces modifications protègent le matériel génétique des phages de la reconnaissance et de la dégradation par les nucléases de l’hôte6. Bien que ces modifications soient cruciales pour la valeur adaptative des phages, elles constituent un obstacle important pour les approches d’ingénierie du génome des phages qui reposent sur des systèmes de ciblage de l’ADN 2,3,7.
Les stratégies de mutagénèse existantes, y compris les systèmes de restriction-modification et les technologies basées sur les protéines CRISPR (CRISPR-associated (CRISPR-associated (Cas), sont confrontées à des défis importants lors de la modification de l’ADN des phages en raison de modifications épigénétiques protectrices telles que la glycosylationde la cytosine 8. L’édition du génome médiée par CRISPR-Cas, qui est très efficace dans les cellules bactériennes et eucaryotes, repose sur deux étapes clés : le clivage précis de l’ADN au niveau des loci génomiques ciblés par la nucléase Cas, suivi de la réparation de l’ADN par recombinaison homologue avec l’ADN du donneur porteur de la mutationsouhaitée 1. Cependant, dans les phages, les modifications de l’ADN empêchent souvent les nucléases Cas de se lier ou de cliver efficacement le génome. De plus, la nature rapide et transitoire de la réplication des phages peut limiter davantage l’efficacité de la recombinaison homologue. Ces barrières rendent particulièrement difficile l’application de la technologie CRISPR-Cas ciblant l’ADN pour la mutagenèse par phage. Il a été démontré que les modifications de l’ADN des phages altèrent le ciblage de l’ADN des phages avec CRISPR-Cas à la fois in vitro et in vivo 6,7.
Pour relever les défis posés par les modifications protectrices de l’ADN dans les phages, nous introduisons une stratégie de mutagenèse du génome qui exploite l’activité de la méthylcytosine dioxygénase de translocation dix-onze (TET), en particulier NgTET. Chez les eucaryotes, les enzymes TET catalysent l’oxydation progressive de la cytosine méthylée par des processus itératifs : la méthylcytosine (5mdC) est d’abord convertie en hydroxyméthylcytosine (5hmdC), puis en formylcytosine (5fdC), et enfin en carboxycytosine (5cadC) (Figure 1).
Dans notre approche de mutagénèse des phages, NgTET est utilisé pour réduire temporairement l’abondance des modifications protectrices de l’ADN, améliorant ainsi l’accessibilité de l’ADN des phages aux outils d’édition du génome tels que les enzymes Cas9. NgTET a été sélectionné pour moduler le génome du bactériophage en raison de rapports antérieurs faisant état de son expression réussie sous forme soluble active chez un hôte bactérien hétérologue, en particulier E. coli. Cette propriété est essentielle, car le NgTET doit rester actif pendant l’infection par les phages10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
Figure 1 : Oxydation par étapes de la 5-méthylcytosine par la TET dioxygénase1. La dioxygénase TET catalyse l’oxydation successive de la 5-méthyl-2'-désoxycytidine (5mdC) en 5hmdC, en 5-formyl-2'-désoxycytidine (5fdC) et finalement en 5-carboxyl-2'-désoxycytidine (5cadC). Le produit final, le 5cadC, redevient spontanément ou enzymatiquement à la cytosine non modifiée (dC), contribuant ainsi à la régulation épigénétique dynamique. Ce processus en plusieurs étapes est essentiel à la méthylation active de l’ADN chez les eucaryotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Étant donné que la méthylcytosine et l’hydroxyméthylcytosine sont des précurseurs communs des hypermodifications de l’ADN des phages, y compris les structures protectrices volumineuses comme les glycosylations, l’activité oxydative de la TET dioxygénase peut être exploitée pour empêcher la formation de ces hypermodifications de l’ADN9. Dans cette approche de mutagenèse du génome basée sur TET, nous exprimons de manière hétérologue NgTET de manière recombinante chez E. coli pour oxyder les cytosines hydroxyméthylées dans le génome du phage lors de l’infection, empêchant ainsi la formation de glycosylation volumineuse. En diminuant l’abondance de ces modifications volumineuses de l’ADN, notre approche peut augmenter l’accessibilité de l’ADN des phages aux nucléases CRISPR-Cas. Cette accessibilité accrue facilite la reconnaissance efficace des cibles, le clivage précis de l’ADN et l’introduction de mutations ponctuelles sans cicatrice dans le génome du phage, ce qui la distingue des méthodes traditionnelles de mutagénèse des phages qui reposent sur des délétions de gènes, des insertions de gènes rapporteurs ou l’intégration de jonctions artificielles pour la sélection de mutants basée sur la PCR 1,11. Ces stratégies conventionnelles ont jusqu’à présent été les seuls outils disponibles pour la mutagénèse ciblée dans les génomes de phages et représentent donc une base importante pour la méthode présentée ici. Cependant, les protéines d’un seul phage peuvent posséder plusieurs fonctions. La délétion de l’ensemble du gène codant pour une protéine d’intérêt perturbe toutes les fonctions associées. En revanche, l’introduction ciblée de mutations ponctuelles permet l’inactivation sélective de fonctions spécifiques, permettant une analyse détaillée de leurs rôles. À ce jour, les fonctions de nombreuses protéines de phages restent largement non caractérisées ; Ainsi, nous pouvons négliger des activités supplémentaires liées à un gène donné. Par conséquent, une approche minimaliste qui vise à supprimer une seule fonction tout en provoquant des changements minimes dans la protéine globale est préférée12,13. La méthode décrite ici permet des modifications génétiques précises sans perturber l’organisation ou la fonction génomique globale. Un autre défi majeur des méthodes précédentes de mutagénèse par phage était leur faible efficacité, qui produisait généralement des taux de mutation d’environ 0,1 %1,11. Avec cette technique, nous présentons la première stratégie de mutagénèse capable d’introduire des modifications d’un seul codon, ce qui permet de multiplier par sept l’efficacité du ciblage. En le combinant avec une méthode de criblage à haut débit basée sur l’ONT, la détection des mutations ponctuelles est simplifiée, éliminant ainsi la nécessité de cribler de grandes populations de phages pour isoler un mutant. La stratégie de mutagenèse basée sur TET décrite ici résout une limitation de longue date dans le domaine et permet une édition du génome plus fiable14.
Dans l’ensemble, cette méthode peut non seulement être appliquée pour faire progresser notre compréhension des mécanismes d’infection par les bactériophages, mais elle est également très prometteuse pour la biologie synthétique. En permettant une ingénierie précise et efficace du génome des phages, elle ouvre la voie à l’adaptation des phages à des applications spécifiques, augmentant ainsi leur potentiel pour des applications biotechnologiques et médicales.

<table><tbody><tr><td>Tubes de réaction de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes canociaux de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène à paroi mince ouverts de 15 ml</td><td>Beckman Coulter Sciences de la vie</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (pour l’ultracentrifugation)</td></tr><tr><td>Tubes canoniques de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x tampon GC</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x Colorant de chargement d’ADN TriTrack&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>Réf. R1161</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BIOSCIENCE des méridiens</td><td>BIO-41025</td><td>Qualité moléculaire</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti J-30I</td><td>Beckman Coulter Sciences de la vie</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>Acide borique&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>ONÉ</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calciumhexahydrat</td><td>ACROS ORGANIQUES</td><td>7774-34-7</td><td>97 %, extra pur&nbsp ;</td></tr><tr><td>Densimètre de cellule</td><td>Biochrom de Harvard&nbsp ;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate disodique</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>Qualité pharmaceutique</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur jetables en verre</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>230 millimètre</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&micro ; L</td></tr><tr><td>Mixage dNTP (10 mM chacun)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>Produit maison.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>Construction plasmidique contenant de l’ARNsg CRISPR-Cas12/ModA</td></tr><tr><td>DS-spCas (système CRISPR-Cas9)</td><td>Addgene&nbsp ;</td><td>48645 (numéro d’accessoire addgene)</td><td>Plasmide pour la construction de plasmides CRISPR-Cas contenant des espaceurs (système CRISPR-Cas9) pour la mutagénèse des phages (étape 3.2)</td></tr><tr><td>La souche B d’E. coli a été utilisée pour l’infection à la T4</td><td>DSMZ</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>Escherichia coli (Migula 1895) Castellani et Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) Souche d’expression, cellule compétente</td><td>Invitrogen</td><td>C600003</td><td>Expression souche, cellules compétentes.</td></tr><tr><td>E. coli DH5 et alpha ; Souche de clonage, cellules compétentes</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>Clonage de la souche, cellules compétentes.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (absolu)&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Cellule d’écoulement Flongle</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>R10.4.1. Chimie, https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Kit de mini-préparation du plasmide Gene JET&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Échelle d’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>Référence SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN GeneRuler ULR&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>Référence SM1213</td><td></td></tr><tr><td>Maître du dégradé 108</td><td>BIOCOMP</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Heraeus Pico 17</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Infors HT Incubateur Minitron</td><td>Infors AG</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>Isopropyl-&bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Carl Roth</td><td>Réf. T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Carl-Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-medium (Luria/Miller)&nbsp ;</td><td>Carl-Roth</td><td>Poste 968.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Appareil MinION&nbsp ;</td><td>Oxfrod Nanopore Technologies</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>Introduction directe pour l’introduction de la mutation ponctuelle pour ModA E165A et pour l’introduction d’extrémités collantes pour le clonage Golden Gate (étape 3.1)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>Amorce inverse pour l’introduction de la mutation ponctuelle pour ModA E165A et pour l’introduction d’extrémités collantes pour le clonage Golden Gate (étape 3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>Amorce avant pour générer un espaceur pour les systèmes CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 pour la mutagenèse et la contre-sélection des phages (étapes 3.2 et 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>Amorce inverse pour générer un espaceur pour les systèmes CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 pour la mutagenèse et la contre-sélection des phages (étapes 3.2 et 4.1)</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop ND-1000&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>Kit NucleoMag&nbsp ;</td><td>Machery Nagel</td><td>RÉF 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de digestion nucléosidique&nbsp ;</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (système CRISPR-Cas13)</td><td>Addgene</td><td>186236 (numéro d’accessoire addgene)</td><td>Système CRISPR-Cas13 codant pour la contre-sélection (étape 4.1)</td></tr><tr><td>Plasmide pCpfl-sp (système CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pCpfl-sp (système CRISPR-Cas12)</td><td>Addgene</td><td>122186 (numéro d’accessoire addgene)</td><td>Plasmide pour la construction de plasmides CRISPR-Cas contenant des espaceurs (système CRISPR-Cas12) pour la mutagénèse des phages (étape 3.2)</td></tr><tr><td>Récipients de réaction PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqGREEN</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET</td><td>Produit maison.</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>plasmide est disponible sur demande, la carte plasmidique peut être trouvée aux https://zenodo.org/records/10615143&nbsp suivants ;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET</td><td>Produit maison.</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>Plasmide pour la construction de pET28a_NgTET_donor ADN via le clonage Golden Gate (étape 3.1), plasmide&nbsp ; est disponible sur demande, la carte plasmidique peut être trouvée aux https://zenodo.org/records/10615143&nbsp suivants ;</td></tr><tr><td>Plaques de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm avec cames</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&micro ; L</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Monobasique</td></tr><tr><td>Bloc d’alimentation universel PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K&nbsp ;</td><td>Carl Roth&nbsp ;</td><td>7528.1</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Kit de purification QIAquick PCR&nbsp ;</td><td>QIAGEN</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Fluormètre Quantus, système dsDNA QuantiFluor</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>RNase A/T1&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>La norme EN0551</td><td>mélanger 2 mg/mL de RNase A 5000 U/mL de RNase T1&nbsp ;</td></tr><tr><td>Roti-Aqua P/C/I pour l’extraction de l’ADN&nbsp ;</td><td>Carl Roth</td><td>Poste X985.1</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>SQK-LSK109 Kit de séquençage de ligature</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>pas de catalogue&nbsp ; nombre</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Filtres Steritop, 0,22 & micro ; M Taille des pores</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 mL et 500 mL</td></tr><tr><td>Streptomycine 50 mg/L</td><td>Carl Roth</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>Succrose</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>pour la biologie moléculaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Rotor oscillant en aluminium&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter Sciences de la vie</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligase 5 U/&micro ; L</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’ADN ligase T4</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à essai, paroi épaisse, sans rebord</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>Thermocycleur, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur confort&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Baignoire d’eau, VWB2&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>Volume de 12 L</td></tr></tbody></table>

mutagénèse précise des phages avec des systèmes crispr-cas assistés par ngtet

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

Identification de la bande lysologique dans le gradient. La visibilité de la bande phage dans le gradient dépend de la concentration de phages dans l’échantillon initial chargé sur le gradient. Lorsque le phage est suffisamment concentré (~&gt;1 × 1011 PFU/mL), la bande peut être clairement visible en éclairant le gradient par le bas avec une source lumineuse (voir Figure 3).
Cependant, à de faibles concentrations de phages, la bande...

Mutagénèse précise des phages avec des systèmes CRISPR-Cas assistés par NgTET

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d'autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Ce protocole décrit le flux de travail d’un gène CRISPR/Cas9-base de montage pour la réparation des mutations ponctuelles dans les cellules de mammifères. Ici, nous utilisons une approche combinatoire de gène avec une stratégie expérimentale suivie détaillée pour mesurer la formation indel au site cible — analyse essentiellement, mutagenèse sur place.

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

SAE-CRISPR est une technologie puissante à l’ingénieur les génomes complexes de plantes et d’animaux. Ici, nous détaillons un protocole pour modifier efficacement le génome humain endonucléases de Cas différents. Nous mettons en évidence les considérations importantes et des paramètres de conception pour optimiser l’efficacité édition.

Modification du génome dans des lignées de cellules mammifères à l’aide de CRISPR-Cas

Nous présentons ici un protocole pour optimiser CRISPR-Cas9 pour parvenir à une plus grande spécificité sans la perte d’activité sur la cible. Nous utilisons une approche d’évolution dirigée appelée Sniper-écran pour trouver un mutant Cas9 avec les caractéristiques souhaitées. Sniper-Cas9 est compatible avec tronqué ARN simple-guide et livraison dans un format ribonucléoprotéines, célèbres stratégies pour atteindre les spécificités plus élevées.

À l’aide de Sniper-Cas9 pour minimiser les effets hors cible de CRISPR-Cas9 sans la perte d’activité sur la cible Via évolution dirigée

Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Cette étude fournit une procédure systématiquement optimisée de construction à base de ribonucléase CRISPR/Cas9 de mutants homozygotes ainsi qu’une méthode détaillée de cryoconservation et de réanimation des œufs de criquets.

Construction de mutants homozygotes du criquet migrateur à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9

Un obstacle important aux technologies comme CRISPR est les événements hors cible qui peuvent perturber les gènes vitaux. La « circularisation pour la notification in vitro des effets de clivage par séquençage » (CIRCLE-seq) est une technique conçue pour identifier les sites de clivage non intentionnels. Cette méthode cartographie l’activité à l’échelle du génome de CRISPR-Cas9 avec une sensibilité élevée et sans biais.

CIRCLE-Seq pour l’interrogation de l’édition de gènes hors cible

Découvrez la mutagénèse CRISPR-Cas sans cicatrice des bactériophages assistée par l'enzyme NgTET. Cette méthode réduit les modifications de l'ADN viral pour améliorer l'ingénierie génétique et la thérapie phagique.

Mutagénèse précise des phages avec des systèmes CRISPR-Cas assistés par NgTET

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