Évaluation des réponses foliaires aux métabolites secondaires microbiens en utilisant un format à haut débit

Mon laboratoire travaille sur les interactions entre les microbes végétaux dans le but ultime d’améliorer la résistance des phoques grâce à la génétique. Des développements récents ont montré que les métabolites secondaires microbiens jouent un rôle clé dans la promotion de la susceptibilité ou de la résistance des plantes. Pour commencer, utilisez un canon en liège de quatre millimètres de diamètre pour collecter trois disques foliaires par plante, tout en évitant la nervure médiane.

Avec l’extrémité tranchante, appliquez un mouvement de torsion pour éviter de macérer le tissu. Ajoutez des métabolites secondaires ou des traitements à solvant à la concentration souhaitée dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits pour atteindre un volume final de 200 microlitres. Placez doucement les disques de feuilles dans les puits.

Placez la plaque à 96 puits dont le couvercle est retiré dans un clochet équipé d’une buse à vide. Ensuite, fixez le tuyau à vide à la buse de cloche et activez la pression sous vide à 9,8 livres par pouce carré pendant 10 secondes. Coupez le vide et relâchez lentement la pression pendant 10 secondes, puis répétez le cycle de vide.

Replacez maintenant le couvercle sur la plaque à 96 puits et faites-le couver sur un shaker orbital sous une source lumineuse. Position à 23 centimètres au-dessus du shaker pendant quatre heures. Lavez la sonde dans de l’eau ultrapure et tamponnez-la légèrement sur une lingette sans peluches pour la faire sécher.

Notez la lecture de conductivité de l’eau pour référence future. Entre quatre et six heures après le traitement, mesurez et enregistrez la conductivité dans chaque puits en immergeant la sonde dans le liquide entourant le disque foliaire. Maintenez la plaque à un angle de 45 degrés pour vous assurer que la sonde est complètement immergée.

Après avoir rincé, la sonde a été démontrée plus tôt, tester occasionnellement la conductivité de l’eau pour confirmer la stabilité de la sonde. Ensuite, placez un film plastique de plafond sur la plaque à 96 puits et remettez le film dans le shaker orbital pour incubation nocturne. Pour préparer le substrat de peroxydase, chauffez 40 millilitres d’eau stérile distillée à 70 degrés Celsius dans un bécher avec une barre de brassage.

Dissoudre 50 milligrammes de cinq acides aminés salicyliques dans de l’eau chauffée. Ensuite, ajoutez de l’eau supplémentaire pour porter le volume total à 50 millilitres et ajustez le pH à six à l’aide de l’hydroxyde de sodium. Protégez la solution photosensible en recouvrant le récipient de papier aluminium.

Dans un tube conique ambré de 50 millilitres, préparez une solution de peroxyde d’hydrogène à 1 % dans de l’eau ultrapure. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution à 1 % de peroxyde d’hydrogène par millilitre de solution à cinq acides salicyliques aminés nécessaire à la génération du milieu de test. Au moment désiré, mélangez cinq fois, puis transférez 50 microlitres de chaque puits de la plaque d’échantillonnage vers une nouvelle plaque.

Ajoutez 50 microlitres du milieu de test et faites éclore à température ambiante pendant trois minutes. Pour arrêter la réaction, ajoutez 20 microlitres de deux hydroxydes de sodium normaux à chaque puits, et utilisez un lecteur de plaques pour mesurer l’absorption de chaque puits à 595 nanomètres. L’eau et le sulfoxyde de diméthyle à 0,1 % ont produit des fuites d’ions et des niveaux d’activité peroxydase similaires, validant leur utilisation comme témoins négatifs.

Le traitement avec une micromolaire FLG 22 a induit significativement une fuite d’ion, une activité de peroxydase et une production de calloses, confirmant qu’il s’agissait d’un contrôle positif robuste. Le traitement à la gramilline a provoqué une fuite d’ions significative et une production de calloses, mais a eu des effets variables sur l’activité de la peroxydase. La surfactine à 10 micromolaires induisait à la fois l’activité de la peroxydase et la production de callose tandis que la fuite ionique restait inchangée.

Le traitement à la toxine T-2 a supprimé l’activité de la peroxydase, tout en induisant la production de callose et sans impact sur la fuite d’ions. Notre analyse hydro permet aux chercheurs d’échantillonner trois réponses différentes au stress dans le même échantillon, ce qui permet aux chercheurs de tirer le meilleur parti de quantités limitées de métabolites secondaires microbiens. La possibilité de comparer 96 échantillons sur la même plaque permet aux chercheurs de réaliser des criblages au niveau de la génétique des populations, ou de la biologie des systèmes, afin de comprendre les interactions entre les microbes des plantes.

Mes recherches continueront de se concentrer sur les interactions entre les micro-plantes et la caractérisation des gènes des plantes que nous pouvons exploiter afin de développer une résistance aux maladies dans les cultures céréalières.