Mesurer le vieillissement monocellulaire avec un biomarqueur de chromatine et de vieillissement épigénétique basé sur l’imagerie

Nous avons développé la chromatine par imagerie et l’image épigénétique de l’âge, une technique novatrice conçue pour quantifier le vieillissement et le rajeunissement à résolution d’une seule cellule. Les horloges de méthylation de l’ADN estiment l’âge biologique, mais dépendent de la régression linéaire, nécessitent de grandes cohortes et détruisent les échantillons, ce qui les rend coûteux et inadaptés aux études à grande échelle ou longitudinales. Pour commencer, transférez les organes et tissus congelés dans un mortier pré-refroidi placé sur de la glace sèche.

Versez de l’azote liquide sur le tissu gelé et broyez-le soigneusement à l’aide d’un pilon pré-refroidi jusqu’à obtenir une poudre uniformément fine. À l’aide d’une spatule métallique pré-refroidie, aliquotez le tissu broyé en plusieurs tubes. Après extraction des noyaux, mélangez-les avec du bleu de trypan dans un ratio égal dans un tube séparé.

Transférez 10 microlitres du mélange à un hémocytomètre, ou chargez-le dans un compteur cellulaire automatisé. Saisissez et vérifiez toutes les métadonnées, y compris les identifiants d’échantillons, les conditions et les biomarqueurs dans la carte des plaques, puis exportez un fichier CSV. Maintenant, distribuez 10 000 noyaux par puits dans un volume de 20 à 30 microlitres dans une plaque de 384 puits.

Centrifugez la plaque à 1000 g, avec l’accélération réglée neuf et la décélération quatre, pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, fixez les noyaux en ajoutant un volume égal de 8 % de paraformoldéhyde et de PBS, puis faites éclore pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le fixateur, ajoutez 30 microlitres de glycine molaire de 0,1 molaire dans le PBS et faites couver pendant cinq minutes à température ambiante.

Retirez la solution de glycine et lavez les puits deux fois avec 100 microlitres de PBS. Retirez le PBS de chaque puits et ajoutez 30 microlitres de solution bloqueante contenant 2 % de BSA et 0,5 % de Triton X-100 dans le PBS. Faites couver l’assiette pendant une heure à température ambiante.

Après avoir retiré la solution bloquante, incubez l’échantillon avec 25 microlitres de solution primaire d’anticorps à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de PBS, chaque lavage durant trois minutes à température ambiante. Ajoutez 25 microlitres de solution secondaire d’anticorps et faites couver pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de PBS, chaque lavage durant trois minutes à température ambiante. Colorez les noyaux avec du DAPI ou du Hoechst en ajoutant 30 microlitres de la teinture à une concentration de 0,01 milligramme par millilitre, puis lavez la plaque une fois avec 100 microlitres de PBS pour éliminer l’excès de colorant. Téléchargez les scripts de workflow depuis le dépôt GitHub.

Une fois le téléchargement terminé, décompressez le fichier pour en extraire le contenu. Organisez le dépôt d’images clonées de manière à ce que la structure du dossier corresponde au format adopté par le flux de travail pour une exécution correcte des scripts. Ensuite, ouvrez l’application Terminal si elle fonctionne sous Linux ou Mac OS, ou l’application WSL si vous utilisez Windows.

Changez le répertoire de travail vers le dossier du dépôt cloné en tapant la commande requise dans le terminal et en appuyant sur Entrée. Créez un nouvel environnement informatique nommé Image_workflow en utilisant Conda avec Python version 3.10 et appuyez sur Entrée. Activez le nouvel environnement Conda avec la commande conda activate Image_workflow.

Installez Poetry, un gestionnaire de paquets Python, dans l’environnement activé en utilisant l’installateur PIP. Ensuite, installez tous les paquets Python nécessaires au flux de travail avec Poetry. Configurez maintenant CUDA dans l’environnement Conda pour permettre la fonctionnalité d’unité de traitement graphique pendant l’étape de segmentation.

Ouvre l’application Terminal et change le dossier pour cloné. Activez l’environnement Conda en tapant la commande ci-dessous et en appuyant sur Entrée. Ouvrez le fichier principal du workflow dans un éditeur de code ou de texte tel que VS Code ou Notepad pour configurer les paramètres d’analyse.

Définir le nom du projet en assignant la variable p à un identifiant safe court du système de fichiers utilisé pour organiser les sorties. Définissez la liste des canaux pour l’extraction des caractéristiques dans les CHS, y compris le canal de segmentation si des caractéristiques de ce canal sont requises. En utilisant ImageIndex et l’étiquette de canal comme clé, associez l’identifiant de canal image des noms de fichiers à l’en-tête exact de la colonne de carte sensible aux majuscules, sauvegardé plus tôt.

Ensuite, définissez les emplacements des données en assignant orgDataLoadPath à la route du jeu de données, orgDataSubfolder au sous-dossier image si nécessaire, et resultsSavePath à la route de sortie. Confirmez l’extension du nom de fichier dans imageFileFormat. Ensuite, modifier imageFileRegEx pour utiliser des groupes de capture nommés en Python pour les parties requises, y compris ligne, colonne, champ, position Z et canal.

Maintenant, réglez le canal de segmentation dans segmentation_ch sur le canal nucléaire utilisé pour la détection d’objets. Décidez si vous utilisez la correction d’illumination en réglant une correction d’illumiCorrection et en la mettant en true pour calculer et appliquer des modèles de base. Ensuite, réglez la taille physique du voxel en micromètres dans voxel_dim comme ZYX en utilisant les métadonnées du microscope.

Sauvegardez le fichier et fermez l’éditeur après avoir vérifié chaque paramètre. Enfin, exécutez le script de workflow pour obtenir les lectures d’images et effectuer la validation, en gardant le terminal ouvert pendant que le script est en cours. Visualisez les résultats et exportez les lectures brutes des images pour une analyse complémentaire dans un logiciel externe.

Des images représentatives de cellules souches pluripotentes induites ont montré des noyaux clairement séparés colorés avec DAPI, une histone H3 triméthylée à la lysine 27, et une histone H3 acétylée à la lysine 27. L’analyse des images des muscles hépatiques et squelettiques a révélé une différence significative entre les échantillons jeunes et vieux, les souris OSKM âgées montrant une image réduite par rapport aux vieilles souris, indiquant une reprogrammation partielle. L’analyse d’animaux individuels a indiqué que certains anciens échantillons d’OSKM présentaient des valeurs d’image significativement réduites par rapport aux vieilles souris.

Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier les changements liés à l’âge dans l’organisation de la chromatine et de l’épigénétique à une seule résolution cellulaire à travers différents types cellulaires et différents tissus. Notre méthode basée sur l’imagerie est non destructive, elle préserve la structure de la chromatine, permet des mesures répétées et est plus rentable dans les études à grande échelle ou longitudinales. Les recherches futures se concentreront sur l’ajout de marqueurs épigénétiques supplémentaires et l’étude des structures intranucléaires liées au vieillissement.