Analyse spécifique au sous-type cellulaire du protéasome de la membrane neuronale dans les neurones somatosensoriels

Nous étudions les mécanismes de la façon dont les neurones somatosensoriels communiquent par l’intermédiaire du protéasome de la membrane neuronale ou NNP récemment découvert pour moduler la façon dont nous percevons le toucher, les démangeaisons et la douleur. Nous avons récemment découvert le protéasome de la membrane neuronale, un complexe spécialisé dans la dégradation des protéines présent dans certains neurones sensoriels, qui fonctionne pour moduler la sensibilité au toucher, aux démangeaisons et à la douleur. Avec ce protocole, nous serons en mesure d’étudier l’expression et la dynamique de modulation de la NMP d’une manière spécifique au type cellulaire dans des conditions de santé et de maladie.

Notre protocole permet d’isoler les neurones exprimant la NMP des neurones non exprimant la NMP afin de pouvoir étudier leur fonction avec une spécificité de type cellulaire. Il est important de noter que ces populations neuronales isolées restent viables pour les analyses en aval. Avec ces protocoles, nous commencerons à étudier comment différentes conditions neuropathiques affectent l’expression et la fonction de la NMP, et comment cela contribue à l’altération du toucher, des démangeaisons et de la sensation de douleur.

Pour commencer, transférez les ganglions de la racine dorsale récoltés dans un tube conique de 15 millilitres. À l’aide d’une pipette, ajoutez sept millilitres de solution de travail de mélange d’enzymes de dissociation tissulaire dans le tube et incubez à 37 degrés Celsius en agitant doucement pendant 20 minutes. Placez le tube dans une centrifugeuse et faites tourner les ganglions à 120 G pendant deux minutes.

Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Remettez les ganglions en suspension dans sept millilitres de mélange d’enzymes de dissociation tissulaire à faible trituration avec de la papaïne. Après avoir centrifugé à nouveau le tube, aspirez et jetez le surnageant.

Ensuite, remettez les ganglions en suspension dans 500 microlitres de solution BSA, TI et DMEM. À l’aide d’une pipette de pâturage en verre poli au feu bouché d’un millilitre, triturez les ganglions 12 à 16 fois. Passez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres pour filtrer les débris cellulaires.

Lavez la passoire avec un millilitre de solution BSA, TI et DMEM pour recueillir les neurones restants des ganglions de la racine dorsale. Transférez la suspension cellulaire filtrée dans un tube conique de 15 millilitres. Préparez un plateau de coloration par immunofluorescence en le tapissant d’un gros morceau de parafilm.

À l’aide d’une pince stérile 5-45, transférez les lamelles de couverture de la boîte de culture tissulaire sur le parafilm, en veillant à ce que le côté contenant les neurones des ganglions de la racine dorsale soit orienté vers le haut. Pipetez lentement 100 microlitres de média pour les ganglions de la racine dorsale sur chaque lamelle pour éviter que les cellules ne se dessèchent. Ensuite, diluez l’anticorps primaire go anti PSM alpha two dans un milieu chaud des ganglions de la racine dorsale pour obtenir une dilution de un à 20.

À l’aide d’un aspirateur muni d’un embout non filtré P10, retirez lentement le support du bord de chaque lamelle. Ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps anti PSM alpha deux à chaque lamelle et incubez à température ambiante pendant 40 minutes. Après cela, aspirez soigneusement la solution d’anticorps primaire de chaque lamelle.

Ajoutez 100 microlitres de PBS à température ambiante dans les cellules et incubez à température ambiante pendant trois minutes pour les laver. Maintenant, pour préparer l’anticorps anti-go secondaire, diluez-le dans un milieu chaud des ganglions de la racine dorsale à une dilution de un à 250. Après avoir terminé le troisième lavage, ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaire diluée dans chaque lamelle.

Incuber les lamelles à température ambiante pendant 40 minutes tout en protégeant les cellules de la lumière. Ensuite, aspirez la solution d’anticorps secondaire des lamelles et lavez les cellules trois fois, en utilisant du PBS comme décrit précédemment. Après le lavage final du PBS, ajoutez 100 microlitres de solution fixatrice contenant 4 % de para formaldéhyde et 4 % de saccharose dans du PBS.

Une fois que les cellules sont incubées à température ambiante pendant 10 minutes, aspirez le fixateur de chaque lamelle. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS comme décrit précédemment. Pour perméabolir les cellules, ajoutez 100 microlitres de détergent non ionique à 0,1 % dans du PBS.

Incuber les lamelles à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez la solution perméable des lamelles et lavez les cellules trois fois, en utilisant le PBS comme décrit précédemment. Ajouter 100 microlitres de solution bloquante composée de 5 % de sérum de bovin fœtal et de 5 % de sérum d’âne dans du PBS à chaque bordereau de couverture.

Ensuite, diluez l’anti CGRP de lapin, la sélectine A conjuguée à quatre biotines B et l’anti NFH de poulet dans la solution bloquante pour préparer le mélange d’anticorps primaires spécifiques au type de cellule neuronale du ganglion de la racine dorsale. Aspirez la solution bloquante des lamelles, puis ajoutez 100 microlitres du mélange d’anticorps primaires préparé à chaque lamelle. Incuber les lamelles à température ambiante pendant 45 minutes tout en les protégeant de la lumière.

Ensuite, retirez la solution d’anticorps primaire des lamelles et lavez les cellules trois fois, en utilisant le PBS comme décrit précédemment. Préparez maintenant le mélange d’anticorps secondaires en diluant la streptavidine, l’âne anti-lapin et l’âne anti-poulet à un à 500 chacun dans une solution de blocage. Aspirez le dernier lavage PBS de chaque lamelle, puis ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaire préparée.

Incuber les lamelles à température ambiante pendant 45 minutes dans l’obscurité. Aspirez le dernier lavage à partir de la lamelle. À l’aide d’une pince à pointe fine, soulevez chaque lamelle du parafilm et épongez doucement l’excès de liquide en touchant le bord de la lamelle sur un mouchoir non pelucheux.

Placez une gouttelette de sept microlitres de support de montage sur une lame de microscope. Abaissez soigneusement la glissière du couvercle sur le support de montage, côté cellule vers le bas, en assurant un contact complet avec le fluide. Placez les lames préparées dans un tiroir ou une boîte sombre et sèche pour qu’elles sèchent pendant au moins une heure.

Scellez le bord de la gaine avec du vernis à ongles à séchage rapide et attendez 10 à 15 minutes avant l’imagerie. Les anticorps se nourrissant sur les neurones vivants des ganglions de la racine dorsale ont révélé une sous-population de neurones avec des protéasomes accessibles en surface, tandis que les échantillons de contrôle dépourvus d’anticorps primaires n’ont montré aucun marquage de surface. La cytométrie en flux a permis d’identifier deux populations distinctes de neurones ganglionnaires de la racine dorsale, en fonction de l’intensité de la fluorescence, séparant les cellules NMP positives des cellules NMP négatives avec des régions de contrôle claires établies, à l’aide de témoins.

La quantification des populations triées en flux a montré qu’environ 4 % des neurones du ganglion de la racine dorsale étaient positifs pour la NMP, tandis que la majorité restante était négative pour la NMP. Les neurones NMP positifs et négatifs NMP triés ont conservé leur viabilité et exprimé les marqueurs spécifiques du type cellulaire NFH, IB 4 et CGRP, confirmant ainsi l’adéquation du flux de travail pour l’analyse moléculaire en aval.