In Vitro Différenciation résidente des cellules T CD8 à mémoire utilisant le système de coculture organoïde-cellules T épithéliales

Nos recherches étudient les lymphocytes T mémoire résidentes du CD8 dans le tube reproducteur féminin, en examinant comment les infections et maladies influencent leur résidence, leur fonction, leur maintien et leur potentiel thérapeutique. Les méthodes existantes limitent la survie et la stabilité phénotypique des lymphocytes T mémoire résidents. Ce protocole permet une étude in vitro évolutive en induisant la résidence tissulaire via une culture culte organoïde des cellules T.

Pour commencer, placez des organoïdes épithéliaux vaginaux ou VEO à une densité de 10 000 cellules dans 20 microlitres d’extrait de membrane basale par puits d’une plaque à 24 puits. Placez l’assiette dans l’incubateur et maintenez les cultures pendant sept à dix jours à 37 degrés Celsius. Un jour avant la co-culture, aspirez le milieu de culture cellulaire des puits désignés et lavez les puits avec du DPBS.

Aspirez le DPBS, puis injectez 600 microlitres d’EDTA à 0,25 % préchauffé dans le puits. À l’aide d’une pipette P1000 recouverte de BSA, resuspendez complètement pour perturber mécaniquement l’extrait de membrane de base et transférez le contenu du puits dans un tube conique stérile de 15 millilitres recouvert de BSA. Maintenant, placez le tube conique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Après cinq minutes, ajoutez 10 millilitres de 10 % de FBS en RPMI pour calmer la trypsinisation. Ensuite, placez le tube dans la centrifugeuse et faites tourner à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant. À l’aide d’une pointe de pipette recouverte de BSA, resuspendez la pellete dans 100 à 300 microlitres de milieu de culture organoïde à cellules T ou de DMEMF 12 simple.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le volume de virus nécessaire pour obtenir une multiplicité d’infection de 0,1 en utilisant le nombre total de cellules et le titre viral connu. Aspirez les milieux de culture cellulaire provenant des puits VEO sélectionnés pour l’infection.

Lavez chaque puits avec 500 microlitres de DPBS préchauffé et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cinq minutes, défaussez le DPBS. Ajoutez 500 microlitres de milieux organoïdes contenant suffisamment de particules virales pour obtenir une multiplicité d’infection de 0,1.

Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure, en faisant doucement tourner la plaque à la main toutes les 20 à 30 minutes. Transférez la quantité appropriée d’extrait de membrane de base nécessaire au placage de moins 80 degrés Celsius à quatre degrés Celsius et laissez dégeler pendant huit heures. Vérifiez les VEO au microscope optique pour évaluer la taille et l’état de santé global.

Confirmez que les VEO mesurent environ 100 micromètres de diamètre, avec une morphologie ronde uniforme et un minimum de cellules uniques. Aspirez le milieu de culture cellulaire des puits VEO et lavez chaque puits avec 500 microlitres de DPBS stérile à froid maintenu entre deux et huit degrés Celsius. Après avoir retiré le DPBS, ajoutez de 200 à 500 microlitres de solution d’organoïde froide dans chaque puits, en assurant un volume au moins 10 fois supérieur à celui de la gouttelette d’extrait de membrane du socle.

Ensuite, à l’aide d’une pipette P200 revêtue de BSA, perturbez mécaniquement l’extrait de membrane du socle. Placez maintenant la plaque sur un vibreur orbital réglé à environ 100 tours par minute à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, utilisez une pointe de pipette revêtue de BSA pour mélanger et transférer le contenu de chaque puits dans un tube conique stérile de 15 millilitres recouvert de BSA.

Placez le tube dans la centrifugeuse et faites tourner à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Puis jetez le surnageant. Lavez la pellete VEO avec cinq à dix millilitres de DPBS froid et centrifugez-la à nouveau à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez le DPBS, puis à l’aide d’une pointe de pipette P1000, resuspendez le pellet dans un millilitre de milieu de culture organoïde T-lymphocyte et placez la suspension VEO sur de la glace jusqu’à ce que les lymphocytes T soient prêts pour la coculture. Pour la collecte des lymphocytes T, vérifiez les lymphocytes T au repos au microscope optique afin d’évaluer la taille et la santé globale. Confirmez que les lymphocytes T présentent un certain regroupement, une morphologie élargie, et aucun débris ou fragment cellulaire visible.

À l’aide d’une pipette P1000, resuspendez les lymphocytes T en les pipettant plusieurs fois dans chaque coin du puits. Prélever un tube conique et compter le nombre total de lymphocytes T CD8 vivants. Ensuite, placez la suspension à cellules T dans la centrifugeuse et faites tourner à 584 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Écartez le surnageant et remettez la pellete de cellules T dans 10 millilitres de milieu de culture organoïde de cellules T. Ensuite, transférez le nombre approprié de lymphocytes T dans le tube conique contenant les VO préalablement préparés pour combiner les cellules. Placez la suspension combinée VEO et T-cell dans la centrifugeuse et tournez à nouveau à 584 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez les VEO et les lymphocytes T dans le volume approprié d’extrait de membrane basale. Ensuite, à l’aide d’une autre pointe de pipette, placez la suspension sur la plaque de culture tissulaire préchauffée, en distribuant 20 microlitres par puits pour une plaque à 24 puits. Inversez maintenant la plaque de culture tissulaire et placez-la à l’envers dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Prévoyez 30 minutes pour l’adhésion complète de l’extraction de membrane de socle et la solidification. Après la période d’incubation, ajoutez soigneusement le milieu de culture organoïde complet des lymphocytes T complété à chaque puits. Distribuez 500 microlitres par puits pour une plaque à 24 puits ou 250 microlitres par puits pour une plaque à 96 puits, en ajoutant le milieu contre le côté du puits pour éviter de perturber la gouttelette d’extrait de la membrane du bazal.

Remplacez le milieu de culture tous les deux jours jusqu’à ce que les échantillons soient prélevés pour l’analyse de cytométrie en flux. Les VEOs de souris âgées de sept jours infectées par le virus de la chorioméningite lymphocytaire exprimant une protéine fluorescente jaune ont montré une réplication virale abondante dès quatre heures après la coculture, visible par les signaux fluorescents à l’intérieur des organoïdes. L’accumulation de lymphocytes T CD8 près des organoïdes infectés est devenue marquante à des moments ultérieurs lors de la co-culture.

L’agrégation progressive des lymphocytes T CD8 était associée à une réduction visible du signal protéique fluorescent jaune chez les organoïdes infectés à des moments ultérieurs. Les lymphocytes T CD8 co-cultivés avec des VEO infectés ont montré une expression accrue de CD 69 et CD 103 au fil du temps, indiquant l’acquisition d’un phénotype mémoire résident dans les tissus. Les lymphocytes T CD69 stimulés par l’antigène, CD103 positifs et CD8 ont montré une augmentation significative de la production intracellulaire d’interféron gamma et d’interleukine-2 par rapport aux témoins non stimulés.

Ce protocole permet une étude in vitro des lymphocytes T mémoire résidentes du CD8, permettant une manipulation efficace des cellules épithéliales et T sans recourir à des modèles animaux. Le défi le plus important de ce protocole est de maintenir des lymphocytes T et des organoïdes épithéliaux vaginaux sains et viables, car une faible viabilité ou une infection compromet la survie en coculture et les résultats expérimentaux. Nous nous sommes concentrés sur l’analyse cytométrique en flux, mais des cocultures peuvent être collectées pour la coloration, l’imagerie et le séquençage.

Le support sûr permet l’ELISA en aval.