Une méthode affinée d’administration intratrachéale de la bléomycine à base d’aérosols pour des modèles murins reproductibles et mini-invasifs de mucoviscidose pulmonaire

Nous visons à développer un modèle de délivrance de médicaments reproductible, minimalement invasif, basé sur des aérosols, pour induire la fibrose pulmonaire et améliorer l’évaluation préclinique des médicaments. Notre modèle permet une administration de médicaments constante et fiable tout en réduisant les traumatismes chirurgicaux et en améliorant la reproductibilité entre les expériences. Nous prévoyons d’appliquer ce modèle pour tester notre thérapie unique pour la fibrose pulmonaire et une lésion pulmonaire clinique.

Pour commencer, à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre, prélève trois millilitres de chlorure de sodium stérile à 0,9 %, puis injecte du chlorure de sodium dans un flacon contenant 15 unités de chlorhydrate de bléomycine. Faites doucement tourner le flacon jusqu’à ce que la poudre de bléomycine soit complètement dissoute pour obtenir une solution de fond de cinq unités par millilitre. Aliquote la solution d’origine dans des tubes microcentrifuge stériles de 1,5 millilitre.

Ensuite, préparez des solutions de travail de 3,75 unités par millilitre et 2,5 unités par millilitre en diluant la crosse avec du sérum stérile. Préparez l’appareil de délivrance d’aérosols en veillant à ce que l’aiguille de nébulisation, la seringue de nébulisation et le pilier de dosage soient tous présents. Immergez la seringue d’administration en aérosol dans une solution saline stérile.

Aspirez lentement le liquide, faites une pause de huit secondes, puis expulsez rapidement le liquide. Ensuite, remplir la seringue avec du sérum physiologique stérile après l’expulsion finale. Fixez l’aiguille aérosolisante et assurez-vous que la jonction est remplie de solution physiologique.

Ensuite, immergez l’aiguille entièrement assemblée dans une solution saline stérile. Pour amorcer l’aiguille aérosolisante avec la solution fonctionnante de la bléomycine, aspirez-la et expulsez-la trois fois avec des pauses de huit secondes entre chaque cycle. Aspirez la solution fonctionnant pour la bléomycine dans la seringue.

Insérez un pilier de dosage de 25 microlitres au-dessus du pilier de 50 microlitres pour calibrer le volume total. Éliminez tout excès de solution. Ensuite, placez la souris anesthésiée sur la plateforme d’intubation.

Accrochez les incisives supérieures à la boucle de fil et attachez les membres pour stabiliser la souris en position. À l’aide de pinces courbes, retirez doucement la langue. Insérez un petit laryngoscope animal pour visualiser et exposer la glotte.

Ensuite, insérez l’aiguille aérosolisante verticalement à travers la glotte exposée et injectez rapidement l’aérosol de bléomycine dans la trachée. Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle. Observez la souris en continu jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie.

Effectuez une pince sur l’orteil pour vérifier les réflexes et confirmez que la souris est vivante. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine a révélé un léger épaississement de la paroi alvéolaire et une fibrose localisée dans le groupe de la bléomycine à cinq unités par kilogramme. Tandis que le groupe des 7,5 unités par kilogramme présentait un effondrement alvéolaire étendu et des lésions fibrotiques sévères.

La quantification du score d’Ashcroft modifié a démontré une augmentation dépendante de la dose de la gravité de la fibrose chez les souris traitées à la bléomycine par rapport aux témoins salins. La coloration trichrome de Masson a révélé une augmentation du dépôt de collagène dans le groupe des cinq unités par kilogramme et une fibrose interstitielle étendue dans le groupe des 7,5 unités par kilogramme. La quantification des zones positives au collagène a confirmé une augmentation significative et dépendante de la dose du dépôt de collagène après le traitement de la bléomycine.

La coloration immunohistochimique a montré une expression accrue de la protéine Col1A1 dans les poumons des deux groupes bléomycine, avec une coloration plus forte et plus large observée dans le groupe des 7,5 unités par kilogramme. La teneur en hydroxyproline était significativement plus élevée dans les deux groupes traités à la bléomycine, confirmant une accumulation accrue de collagène dans les tissus pulmonaires. L’adhésion pulmonaire statique a été significativement réduite de manière dépendant de la dose chez les groupes traités à la bléomycine.

La capacité inspiratoire était significativement inférieure uniquement dans le groupe de 7,5 unités par kilogramme de bléomycine comparé au sérum physiologic. Les élastines du système respiratoire ont augmenté significativement dans le groupe des 7,5 unités par kilogramme par rapport au sérum physiologique. La compliance du système respiratoire a diminué significativement uniquement dans le groupe des 7,5 unités par kilogramme.