Name: Analyse optimisée des protéines des ovocytes et des embryons de xénope par immunobuvardage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Apprenez l'analyse optimisée des protéines par immunobuvardage dans les ovocytes et embryons de xénope. Ce protocole détaillé permet d'étudier les mécanismes de régulation translationnelle et les régulateurs de sulfate.

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Tous les travaux avec des animaux (X. laevis) représentés dans ce protocole sont conformes et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’UW-Madison. Les détails de l’équipement, des réactifs utilisés et des concentrations d’anticorps utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux. Une sélection d’équipements peut être vue dans la figure 2, ci-dessous.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig2.jpg"> 
Figure 2 : Extrait d’embryon traité et équipement d’immunobuvardage. (A) Extrait d’ovocyte centrifugé de stade VI de X. laevis. Les lipides et les protéines liposolubles remontent vers le haut tandis que la vitellogénine (jaune) et les débris pigmentés forment une pastille. (B) Équipement pour SDS-PAGE permettant de séparer les protéines par poids moléculaire. (i) Alimentation électrique, (ii) Réservoir d’électrophorèse vertical, (iii) Couvercle du réservoir d’électrophorèse, (iv) Ensemble d’électrodes, (v) Barrage tampon, (vi) Gel d’électrophorèse préfabriqué ; Notez le peigne vert (en haut) et l’autocollant bleu (en bas), qui doivent chacun être retirés. (C) Équipement pour le transfert membranaire. Le réservoir d’électrophorèse vertical et le couvercle sont réutilisés pour le transfert après un rinçage complet. (i) Rouleau pour enlever les bulles, (ii) Clip de transfert, (iii) Petit agitateur, (iv) Membrane de nitrocellulose entre deux feuilles de papier bleu de protection, (v) Papier filtre de chromatographie cellulosique, (vi) Coussins éponge de transfert, (vii) Plat de cuisson en verre pour l’assemblage de transfert, (viii) Bloc réfrigérant, (ix) Noyau de transfert. (D) Autre équipement. (i) Libérateur de gel (pour couper les puits de gel avant le transfert), (ii) Levier d’ouverture de la cassette de gel, (iii) Pince (pour la membrane de manipulation), (iv) Récipient (pour la membrane de maintien), (v) Couvercle du récipient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1. Collecte d’ovocytes et d’embryons de xénope 
<ol>
	<li>Préparation des ovocytes<ol>
		<li>Obtenir des ovocytes défolliculés de X. laevis auprès d’un fournisseur commercial (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) ou isoler et défolliculer comme décrit8.</li>
		<li>Cultiver des ovocytes isolés dans une solution de Barth modifiée (MBS ; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,4 mM CaCl2, 0,33 mM Ca(NO3)2, 0,8 mM MgSO4, 5 mM Tris-HCl, 2,4 mM NaHCO3, pH 7,4) jusqu’à utilisation.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation de l’embryon<ol>
		<li>Isolez les œufs de X. laevis et fécondez-les comme décrit 9,10.</li>
		<li>Culture d’embryons fécondés dans 0,25x Marc’s Modified Ringer’s solution11 (MMR) (1x MMR : 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES).</li>
		<li>Préparez une solution de cystéine à 2 % dans 0,1x MMR avec le pH ajusté à 8,2 à l’aide de NaOH.</li>
		<li>Retirez 0,25x MMR de la boîte utilisée pour la fécondation et couvrez les embryons avec la solution de cystéine pour enlever la couche de gelée12. Mélangez doucement la solution pour que les embryons soient uniformément exposés.</li>
		<li>Surveillez de près les embryons à l’aide d’un stéréomicroscope d’un grossissement de 2x à 25x. Une fois que la couche de gelée s’est dissoute (généralement 3 à 5 minutes), les embryons se regroupent étroitement. Évitez l’exposition prolongée à la cystéine.</li>
		<li>Retirez la solution de cystéine et rincez les embryons plusieurs fois avec un MMR 0,25x.</li>
		<li>Cultivez à 0,25x MMR jusqu’au stade de croissance souhaité.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prélever le nombre désiré d’embryons ou d’ovocytes (recommandé au moins cinq par échantillon) dans un tube de 1,5 ml.</li>
	<li>Retirez l’excès de média à l’aide d’un pipeteur, en évitant d’endommager les cellules.</li>
	<li>Utilisez les échantillons immédiatement ou conservez-les à -80 °C jusqu’à utilisation. Les ovocytes et les embryons peuvent être conservés pendant plusieurs années.</li>
</ol>
2. Préparation de l’extrait de xénope
<ol>
	<li>Décongeler les échantillons sur de la glace s’ils sont congelés.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de tampon de lyse cellulaire 10x réfrigéré dilué à 1x avec de l’eau double désionisée (voir le tableau des matériaux) par embryon/ovocyte et homogénéiser les échantillons avec un micropilon sur glace.</li>
	<li>Étalage d’échantillons à 5000 g à 4 °C dans une centrifugeuse de paillasse pendant 10 minutes pour éliminer les débris de granulés, y compris le jaune d’œuf et les pigments insolubles.</li>
	<li>Retirer le surnageant dans un tube séparé de 1,5 mL, en prenant soin d’éviter la pastille (figure 2A).</li>
	<li>Ajouter au surnageant un volume égal de tampon d’échantillon 2x Laemmli complété par 5 % p/v de 2-mercaptoéthanol et faire bouillir pendant 10 min à 95-100 °C pour dénaturer les protéines de l’échantillon.</li>
	<li>Utilisez les échantillons immédiatement ou conservez-les à -20 °C pendant des mois ou des années.</li>
</ol>
3. PAGE DE DSS
<ol>
	<li>Préparez la mémoire tampon de fonctionnement de la FDS : 1 tampon Tris-MOPS-SDS (6,06 g de base Tris, 10,46 g d’acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique [MOPS], 1,0 g de SDS, 0,3 g d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA], eau désionisée double à 1000 mL).</li>
	<li>Retirez un gel préfabriqué bis-tris SDS à 4-12 % de l’emballage. Retirez l’autocollant au bas du gel.</li>
	<li>Insérez le gel dans l’ensemble d’électrodes situé à l’opposé d’une digue tampon. Placez l’ensemble d’électrodes dans le réservoir d’électrophorèse vertical (Figure 2B).</li>
	<li>Remplissez l’ensemble d’électrodes et le fond du réservoir d’électrophorèse avec 1x tampon de fonctionnement Tris-MOPS-SDS.</li>
	<li>Retirez délicatement le peigne de gel du gel et faites couler la pipette dans les puits pour éliminer les bulles et équilibrer le tampon.</li>
	<li>Chargez soigneusement 5 μL d’étalons de protéines pré-colorés dans le premier puits et 10 μL de chaque échantillon dans les puits supplémentaires.</li>
	<li>(FACULTATIF) Chargez les puits restants avec 10 μL de 1 tampon d’échantillon Laemmli pour que le gel s’écoule plus uniformément.</li>
	<li>Placez le couvercle sur le réservoir d’électrophorèse et connectez-le à une source d’alimentation. Appliquer 200 V.</li>
	<li>Arrêtez l’électrophorèse lorsque le front du colorant du tampon d’échantillon sort du gel.</li>
</ol>
4. Transfert humide de protéines sur une membrane
<ol>
	<li>Pendant l’électrophorisation des échantillons, préparer 1 L de tampon de transfert (3,0 g de Tris Base, 4,08 g de bicine, 900 mL d’eau double désionisée, 100 mL de méthanol). Pré-refroidissez le tampon de transfert à 4 °C. ATTENTION : Manipulez les stocks de méthanol concentrés dans une hotte et évitez tout contact avec la peau. Le méthanol peut être remplacé par de l’éthanol.</li>
	<li>Avant la fin de l’électrophorèse, commencez à assembler le « sandwich » de transfert dans le clip de transfert (Figure 2C).<ol>
		<li>Remplissez un plat de cuisson en verre avec un tampon de transfert réfrigéré. Lors des étapes d’assemblage sandwich suivantes, assurez-vous que les matériaux sont immergés dans ce tampon.</li>
		<li>Placez la pince de transfert dans le plat avec la moitié noire posée contre le fond du plat, la moitié blanche ouverte et pointue vers le haut, et la pince de transfert ouverte vers la gauche.</li>
		<li>Posez une ou deux éponges en fibres à plat sur la moitié noire du clip de transfert.</li>
		<li>Coupez deux papiers de chromatographie cellulosique de 0,35 mm (papiers filtres) à la bonne taille et posez-en un sur les éponges.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Une fois l’électrophorèse terminée, retirez le gel du réservoir d’électrophorèse.</li>
	<li>Séparez soigneusement les plaques du gel à l’aide du levier d’ouverture de la cassette de gel, en vous assurant que le gel reste attaché à l’une des plaques (Figure 2D). Coupez les puits par le haut du gel avec le libérateur de gel.</li>
	<li>Placez le gel, toujours fixé à la moitié de la cassette en plastique, sur le papier filtre. Retirez la moitié de la cassette pour que le gel reste sur le papier filtre.</li>
	<li>Découpez un carré de membrane nitrocellulosique de 0,45 μm pour l’adapter aux dimensions du gel. Retirez la membrane du papier de protection, mouillez-la brièvement dans le tampon de transfert et placez-la sur le gel. REMARQUE : Manipulez la membrane avec précaution par les coins avec des gants ou des pinces pour éviter une contamination protéique indésirable de la membrane.</li>
	<li>Placez un deuxième papier filtre sur la membrane de nitrocellulose. Retirez délicatement mais fermement les bulles à l’aide d’un rouleau sur le papier filtre.</li>
	<li>Empilez une à deux autres éponges en fibres sur le papier filtre.</li>
	<li>Fermez la cassette de transfert et fermez-la hermétiquement, complétant ainsi le « sandwich ».</li>
	<li>Insérez le sandwich de transfert dans le noyau de transfert avec le clip de transfert vers le haut et le côté noir du clip de transfert face au côté noir du noyau.</li>
	<li>Placez le noyau de transfert dans le réservoir d’électrophorèse. Ajoutez un sac de glace et une barre d’agitation à l’aquarium afin que la barre d’agitation puisse tourner librement. REMARQUE : En plus ou à la place d’un bloc réfrigérant, le transfert peut être effectué dans une chambre froide à 4 °C à l’étape 4.13.</li>
	<li>Remplissez le réservoir avec un tampon de transfert réfrigéré. Fixez fermement le couvercle sur le dessus.</li>
	<li>Connectez l’appareil de transfert à l’alimentation électrique, en veillant à aligner les couleurs des électrodes. Faites fonctionner le transfert pendant 1 h, 100 V, à 4 °C, avec la barre d’agitation en rotation.</li>
</ol>
5. Traitement de la membrane post-transfert
<ol>
	<li>Préparez 10 solutions salines tamponnées en tris (100 mM de base de tris ; 1,5 M de NaCl). Ajustez le pH à 8 et filtrez la stérilisation.</li>
	<li>Préparez 1 solution saline tamponnée au Tris avec Tween-20 (TBSTw) en diluant 10 solution TBS 1:10 dans 500 mL d’eau double désionisée et en ajoutant 500 μL de Tween-20.</li>
	<li>Préparez un tampon de blocage (500 mL de TBSTw, 25 g de lait écrémé en poudre). REMARQUE : Le lait écrémé peut être remplacé par de l’albumine sérique bovine (BSA) à 2-5 % dans le tampon de blocage. La BSA doit être utilisée si l’application expérimentale implique la visualisation de protéines biotinylées, car le lait contient de la biotine.</li>
	<li>Une fois le transfert terminé, retirez et démontez soigneusement le sandwich et retirez la membrane de nitrocellulose. Marquez quel côté de la membrane était en contact avec le gel et gardez ce côté face vers le haut dans les étapes suivantes.</li>
	<li>Préparez 50 mL de colorant Ponceau (0,5 % Ponceau S, 1 % d’acide acétique), un colorant réversible pour la visualisation des protéines. ATTENTION : La tache de Ponceau est corrosive. Évitez tout contact avec la peau.</li>
	<li>Placez la membrane dans un petit récipient (comme illustré à la figure 2D) de manière à ce qu’elle repose au ras du fond du récipient. Recouvrez la membrane de teinture Ponceau jusqu’à immersion et balancez-la doucement sur une bascule pendant 5 à 10 min.</li>
	<li>Videz la tache de Ponceau. REMARQUE : La teinture Ponceau peut être réutilisée plusieurs fois.</li>
	<li>Rincez la membrane à plusieurs reprises à l’eau doublement désionisée jusqu’à ce que l’excès de Ponceau soit éliminé et que les bandes de protéines dans les couloirs commencent à se résorber.</li>
	<li>Confirmez l’efficacité du transfert par la présence de voies droites et régulières avec des bandes clairement résolues.</li>
	<li>Videz tout liquide restant et plongez le transfert dans un tampon de blocage pour empêcher les anticorps non spécifiques de se lier à la membrane dans les étapes en aval.</li>
	<li>Balancez-vous doucement sur une bascule pendant 30 à 60 minutes à température ambiante.</li>
</ol>
6. Incubation d’anticorps
<ol>
	<li>Diluer l’anticorps primaire dans 10 mL de tampon de blocage frais à la concentration désirée. REMARQUE : La concentration optimale devra être déterminée empiriquement pour chaque nouvel anticorps. Un point de départ typique est le 1:1000, ou bien suivre les recommandations du fabricant.</li>
	<li>Retirez le tampon de blocage et remplacez-le par le mélange d’anticorps. Incuber, en se balançant doucement, toute la nuit (~16 h) à 4 °C.</li>
	<li>Videz la solution d’anticorps primaires et rincez la membrane avec du TBSTw en l’immergeant dans la solution et en la versant rapidement. REMARQUE : La plupart des mélanges d’anticorps peuvent être conservés et réutilisés deux à trois fois. Cela doit être déterminé empiriquement pour chaque anticorps.</li>
	<li>Lavez la membrane en l’immergeant dans TBSTw et en la balançant doucement à température ambiante pendant 5 min. Effectuez trois lavages de 5 minutes au total.</li>
	<li>Diluer l’anticorps secondaire dans 30 mL de TBSTw à la concentration désirée. REMARQUE : La concentration devra être déterminée empiriquement pour chaque anticorps. Nous utilisons généralement 1:30 000.</li>
	<li>Versez la solution de lavage TBSTw et remplacez-la par le mélange d’anticorps secondaire. Incuber, en se balançant doucement, pendant 45 min à température ambiante.</li>
	<li>Rincez rapidement la membrane une fois avec TBSTw, suivie de trois lavages TBSTw de 5 minutes.</li>
</ol>
7. Imagerie de la membrane sur un révélateur de film
<ol>
	<li>Dans une chambre noire, allumez le révélateur de film et laissez-le se réchauffer.</li>
	<li>Coupez deux carrés de pellicule plastique assez grands pour englober la membrane. À l’aide d’une pince, placez la membrane de nitrocellulose sur le premier carré de pellicule plastique.</li>
	<li>Dans un tube de 1,5 ml, mélangez des quantités égales de réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL) Luminol et Enhancer. L’utilisation de 1 mL de la solution mélangée devrait couvrir la plupart des membranes.</li>
	<li>Pipetez le réactif ECL sur la membrane et manipulez doucement la membrane à l’aide de la pellicule plastique pour assurer une couverture complète. Incuber pendant 1 min.</li>
	<li>Éliminez l’excès de réactif ECL en saisissant la membrane à l’aide d’une pince et en secouant doucement le liquide ou en évacuant le liquide en touchant un coin de la membrane sur une serviette en papier.</li>
	<li>Placez la membrane face vers le haut sur le deuxième carré de pellicule plastique et pliez la pellicule plastique sur la membrane jusqu’à ce qu’elle soit mal scellée. Collez solidement la membrane enroulée dans une cassette d’autoradiographie.</li>
	<li>Dans la chambre noire, placez un film à l’intérieur de la cassette, en recouvrant la membrane collée. Fermez bien la cassette et exposez le film à la membrane pendant 1 min.</li>
	<li>Retirez délicatement le film en faisant attention de ne pas faire glisser le film exposé le long de la membrane. Introduisez-le dans le révélateur de film.</li>
	<li>Lors de l’évaluation du film développé, ajustez le temps d’exposition avec les films suivants jusqu’à ce que la visualisation souhaitée des protéines soit obtenue. Si la visualisation de la protéine fournit un signal faible, répétez l’étape d’incubation du réactif ECL avec un réactif ECL plus sensible et réimagez-la.</li>
	<li>Alignez le film développé avec les marqueurs phosphorescents et utilisez cette référence pour marquer la position des étalons protéiques pré-colorés sur la membrane sur le film.</li>
	<li>Une fois l’imagerie terminée, retirez soigneusement la membrane de la pellicule plastique et plongez-la dans du TBSTw pour éliminer le réactif ECL restant.</li>
</ol>
8. (Facultatif) Incubations d’anticorps supplémentaires
REMARQUE : Le stripping d’un immunoblot consiste à éliminer les anticorps primaires et secondaires initiaux à l’aide d’une solution dénaturante (tampon de stripping) afin que le blot puisse être sondé à nouveau avec un anticorps différent. Le re-sondage permet d’analyser le même immunoblot pour l’expression de différentes cibles protéiques et de comparer des protéines inconnues à des protéines bien caractérisées qui fonctionnent comme des normes. Sonde avec l’anticorps qui produit le signal comparativement le plus faible en premier. Ce faisant, on évite les artefacts causés par des anticorps incomplètement dépouillés lors d’expositions ultérieures et on minimise l’impact de la perte de protéines due au stripping répété d’un transfert.
<ol>
	<li>Éliminez les anticorps liés en immergeant la membrane dans le tampon de décapage et en la balançant doucement pendant 5 à 10 minutes.</li>
	<li>Retirez la membrane du tampon de décapage et rincez brièvement dans TBSTw pour éliminer toute solution de décapage résiduelle.</li>
	<li>Immergez la membrane dans un tampon de blocage et basculez doucement pendant 30 min.</li>
	<li>Préparez une nouvelle solution d’anticorps primaires dans un tampon de blocage avec la concentration souhaitée.</li>
	<li>Ajoutez la nouvelle dilution d’anticorps primaire à la membrane et incubez doucement en berçant pendant une nuit à 4 °C.</li>
	<li>Procédez à partir de l’étape 6.3. La membrane peut être décappée et sondée jusqu’à trois fois supplémentaires.</li>
</ol>

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<li>Chicoine, J., Benoit, P., Gamberi, C., Paliouras, M., Simonelig, M., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
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</ol>

La compréhension des mécanismes cellulaires nécessite la surveillance d’espèces protéiques spécifiques. Les questions courantes incluent comment ils changent d’expression dans l’espace et dans le temps, avec quelles protéines ils interagissent et si elles sont modifiées en réponse à différentes conditions. L’immunobuvard, familièrement connu sous le nom de « transfert Western », est une méthodologie clé pour relever ces défis. Une expérience d’immunotransfert sépare les protéines d’un échantillon complexe - par exemple, le lysat de cellules entières - et les identifie à l’aide d’anticorps. Plus précisément, les protéines sont dénaturées puis séparées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) par taille. Les protéines fractionnées sont transférées sur un support solide, tel qu’une membrane de nitrocellulose, et la protéine d’intérêt est identifiée à l’aide de réactifs d’anticorps. L’immunobuvardage est devenu un élément standard de la boîte à outils du biologiste moléculaire. Il est couramment utilisé pour surveiller l’expression des protéines dans différents contextes ou comme critère d’évaluation pour des expériences telles que les tests d’immunoprécipitation. Malgré ces avantages, l’analyse des niveaux de protéines à l’état d’équilibre avec l’immunoblot s’avère difficile, car le test doit être optimisé pour chaque étape et contexte expérimental (Figure 1).
L’un des contextes difficiles est l’analyse du matériel de la grenouille à griffes africaines Xenopus laevis. X. laevis est un organisme important pour l’étude des interactions ARN-protéines. Ce système présente de nombreux avantages, dont le principal est que X. laevis produit des centaines d’ovocytes et développe ensuite des embryons de manière synchrone. Chaque ovocyte contient ~25 μg de protéine1 autre que le vitelllin, fournissant un matériel abondant pour les expériences biochimiques. La grande taille (~1250 μm)1 des ovocytes et des embryons facilite également la micro-injection d’ARNm pour exprimer exogène des protéines marquées ou mutées à l’échelle2. Ces qualités permettent des expériences puissantes pour tester le contrôle traductionnel chez X. laevis, telles que le test de la fonction attachée, dans lequel l’impact d’une protéine régulatrice translationnelle sur un ARNm peut être analysé indépendamment de la capacité de cette protéine à se lier à l’ARN 3,4,5,6. Cependant, l’immunotransfert dans les ovocytes et les embryons de xénope présente des difficultés, notamment l’interférence de grandes masses de plaquettes vitellines dansces cellules précoces7, qui obscurciront les résultats si elles ne sont pas éliminées.
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour un immunotransfert efficace chez X. laevis, en mettant l’accent sur la détection des protéines régulatrices translationnelles. Nous fournissons des instructions sur la façon de collecter et de traiter les ovocytes et les embryons jusqu’à l’imagerie de l’immunotransfert final. Des instructions détaillées sont également incluses pour un chargement et une imagerie optimaux des protéines, ainsi que pour prévenir la contamination de l’échantillon par le jaune. De plus, nous discutons des modifications possibles du protocole et des stratégies pour trouver des anticorps compatibles avec les protéines Xénope . Nous avons l’intention de fournir aux chercheurs des conseils pour effectuer sans effort l’immunotransfert dans le cadre de leurs propres expériences sur cet organisme modèle sous-utilisé.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig1.jpg"> 
Figure 1 : Flux de travail pour la préparation des échantillons de xénope et l’analyse ultérieure par immunoblot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Enveloppe Premium Heavy Duty de 100 pieds carrés</td><td>Saran</td><td>2570000130</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse cellulaire 10x</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#9803</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Plat oblong de 2 quarts pour la cuisson/service</td><td>Pyrex</td><td>71160010116</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampon d’échantillons de Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps à haute affinité anti-HA</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Préparé comme indiqué et utilisé à 1:10 000 de dilution.</td></tr><tr><td>Anti-IgG du lapin, anticorps lié à HRP</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>7074S</td><td>Utilisé à 1:30 000 dilution.</td></tr><tr><td>Cassette d’autoradiographie, 5 x 7 pouces</td><td>Produits de recherche International</td><td>420057</td><td>Ce n’est pas nécessaire si vous utilisez un système d’imagerie numérique.</td></tr><tr><td>Pilons jetables Bel-Art</td><td>Millipore Sigma</td><td>BAF199230001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps du lapin Bicaudal-C (humain)</td><td>Envigo Bioproduits (aujourd’hui Inotiv)</td><td>N/A</td><td>Commandé sur mesure. Utilisé à une dilution de 1:20 000.</td></tr><tr><td>Anticorps du lapin Bicaudal-C (Xénopus)</td><td>Envigo Bioproduits (aujourd’hui Inotiv)</td><td>N/A</td><td>Commandé sur mesure. Utilisé à une dilution de 1:20 000. Réf. Park et al., 2016</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Un substitut au lait écrémé dans le tampon de blocage.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5425</td><td>Eppendorf</td><td>13-864-456</td><td></td></tr><tr><td>CL-XPosure Film</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34091</td><td>Ce n’est pas nécessaire si vous utilisez un système d’imagerie numérique.</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de lapin CNOT1 (D5M1K)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#44613</td><td>Utilisé à une dilution de 1:2 000.</td></tr><tr><td>DDX6/RCK (D26C11) Anticorps monoclonal de lapin</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#8988</td><td>Utilisé à une dilution 1:5 000.</td></tr><tr><td>Développeur E-Z Store and Pour</td><td>MXR Imaging</td><td>103633</td><td>Ce n’est pas nécessaire si vous utilisez un système d’imagerie numérique.</td></tr><tr><td>Magasin E-Z et Fixeur de Coulettes</td><td>MXR Imaging</td><td>114511</td><td>Ce n’est pas nécessaire si vous utilisez un système d’imagerie numérique.</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal GAPDH</td><td>ProteinTech</td><td>60004-1-IG</td><td>Utilisé à une dilution de 1:40 000.</td></tr><tr><td>Démantèlement de gel</td><td>Bio-Rad</td><td>#1653320</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) de chèvre, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>A16066</td><td>Préparé comme indiqué et utilisé à 1:40 000 de dilution.</td></tr><tr><td>Poche de glace, 8 oz, 5 x 3 x 1"</td><td>Uline</td><td>S-18256</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Processeur de film médical</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td>Ce n’est pas nécessaire si vous utilisez un système d’imagerie numérique.</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp ; Levier d’ouverture de cassette</td><td>Bio-Rad</td><td>#4560000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp ; Cellule d’électrophorèse verticale Tetra</td><td>Bio-Rad</td><td>#1658004</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir d’électrophorèse MSE PRO 700 ml Western Blot</td><td>MSE Supplies</td><td>BB2369</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de nitrocellulose, 0,45 & micro m</td><td>Bio-Rad</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>Lait sec écrémé</td><td>Sanalac</td><td>1570000180</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniIgG anti-rat pour chèvres (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-035-003</td><td>Préparé comme indiqué et utilisé à une dilution 1:100 000.</td></tr><tr><td>Polysorbate (préados) 20</td><td>Bioréactifs de Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>K793-500ML</td><td>Une approximation peut être faite avec 0,5 % de Ponceau S, 1 % d’acide acétique</td></tr><tr><td>Alimentation de base PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Culbuteur 2D à vitesse variable PR1MA</td><td>MidSci</td><td>R2D-30</td><td></td></tr><tr><td>Échelle des normes bicolores Precision Plus Protein</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610374</td><td>N’importe quelle échelle protéique de votre choix peut être utilisée.</td></tr><tr><td>Papier filtre chromatographie pure à cellulose, 0,35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-4</td><td></td></tr><tr><td>Restaurer le tampon de dépouillement des taches occidentales</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#21059</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Chemical</td><td>S640-10</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de stockage 300 mL</td><td>Rosti Mepal</td><td>RST46608</td><td>Pour le blocage de membranes à la nitrocellulose, l’incubation des anticorps et les lavages</td></tr><tr><td>Substrat de sensibilité maximale SuperSignal West Femto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#34094</td><td>Un substrat chimiluminescent amélioré (ECL) contenant deux composants : le luminol et l’améliorateur. Ce réactif ECL présente une faible sensibilité au femtogramme.</td></tr><tr><td>Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico PLUS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#34580</td><td>Un substrat chimiluminescent amélioré (ECL) contenant deux composants : le luminol et l’améliorateur. Ce réactif ECL a une sensibilité picogramme-femtogramme.</td></tr><tr><td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4&ndash ; 12 %, 10 puits de gels de polyacrylamide</td><td>GenScript</td><td>M00652</td><td></td></tr><tr><td>Poudre tampon de transfert</td><td>GenScript</td><td>M00652</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>USBiological</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-MOPS-SDS poudre tampon courante</td><td>GenScript</td><td>M00138</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse optimisée des protéines des ovocytes et des embryons de xénope par immunobuvardage

Optimized Analysis of Proteins from Xenopus Oocytes and Embryos by Immunoblotting

Pour démontrer l’efficacité de notre protocole d’immunobuvardage, nous avons analysé des protéines de contrôle traductionnel endogènes et marquées par affinité dans trois types d’échantillons de X. laevis : les ovocytes de stade VI, les embryons de stade 7 (blastula) et les embryons de stade 10,5 (gastrula). Ces stades ont été choisis parce qu’ils couvrent la transition mi-blastula (stade 8.5), qui marque le début de la transcription zygotique robuste13,14. Étant donné que le développement avant la transition mi-blastula se produit en l’absence de transcription, les embryons prézygotes (c’est-à-dire contrôlés par la mère) dépendent fortement des mécanismes de contrôle de la traduction pour exprimer les protéines du destin cellulaire à la bonne résolution temporelle et spatiale15. Par conséquent, la transition mi-blastula est un contexte essentiel dans lequel étudier les interactions ARN-protéines.
Pour analyser l’expression protéique par immunoblottage, on a injecté à des ovocytes et des embryons de X. laevis 500 pg d’ARNm codant pour la moitié C-terminale de X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) fusionnée à 3 marqueurs d’affinité d’hémagglutinine (HA). Nous avons choisi d’analyser Bicc1 en raison de sa pertinence pour la biologie du xénope et les interactions protéine-ARN. Bicc1 est une protéine de liaison à l’ARNm et un répresseur translationnel qui guide les décisions relatives au destin cellulaire dans l’embryon précoce 16,17,18. Plus tard dans le développement, il a un impact sur la structuration gauche-droite 19,20,21 et la fonction des organes, y compris les reins 22,23,24,25. Bicc1 contient une région qui dirige la répression traductionnelle5 et les domaines d’homologie hnRNP K (KH) qui médient la liaison à des ARNm spécifiques 5,26,27,28.
Des extraits ont été préparés à partir de cinq ovocytes ou embryons injectés par HA-Bicc1, ainsi que d’échantillons non injectés correspondants en tant que témoins négatifs. Un dixième de chaque extrait a été électrophorisé sur un gel de bis-tris à gradient de 4 à 12 % et transféré par voie humide sur une membrane de nitrocellulose. La coloration Ponceau de la membrane pour détecter la protéine totale a confirmé le transfert réussi (Figure 3A). Dans le cadre de nos études, nous avons généré chez le lapin un anticorps qui reconnaît la moitié C-terminale de la protéine Bicc1 humaine. Cet anticorps a été utilisé pour détecter les protéines Xl-Bicc1 endogènes et exogènes (Figure 3B). Des travaux antérieurs ont montré que la protéine Bicc1 est absente des ovocytes de X. laevis , mais qu’elle est exprimée dans les embryons pré-MBT, avant que le génome zygotique ne soit actif16. Cela suggère que si l’ARNm de Bicc1 s’accumule pendant l’ovogenèse, il est réprimé par translation. En accord avec ces travaux précédents, Bicc1 endogène n’a pas été détecté dans les ovocytes. En revanche, l’anticorps a reconnu Bicc1 endogène (~MW 107 kDa) dans les embryons de stade 7 et 10,5. Pris ensemble, ces résultats valident que l’anticorps reconnaît la protéine endogène Bicc1 (Figure 3B, panneau supérieur, pointe de flèche rouge). L’anticorps Bicc1 a reconnu une protéine plus petite d’environ 70 kDa dans des extraits préparés à partir d’échantillons injectés d’ARNm (figure 3B, panneau supérieur, pointe de flèche noire, comparez les voies 2, 4 et 6 avec les voies 1, 3 et 5). Pour contrôler la spécificité de l’anticorps Bicc1, la membrane a été décapée et sondée à nouveau avec un anticorps contre l’étiquette d’affinité HA. L’anticorps HA a identifié la protéine 70 kDa dans les échantillons injectés, mais n’a pas reconnu le Bicc1 endogène (figure 3B, deuxième panneau, pointe de flèche noire). L’intensité de la détection du terme C HA-Bicc1 varie d’un stade à l’autre en raison des différences d’expression des protéines de l’ARNm injecté dans les différents types de cellules.
Ensuite, nous avons élargi les résultats en testant l’expression de protéines régulatrices traductionnelles endogènes qui interagissent avec Bicc1. Tout d’abord, nous avons analysé l’expression de Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1 (Cnot1), une grande protéine d’échafaudage et une partie du complexe Ccr4-Not deadenylase (CNOT). Le complexe multi-sous-unitaire CNOT est l’une des principales deadenylases eucaryotes et est principalement connu pour couper la queue poly(A) à l’extrémité des ARNm messagers en prélude à leur dégradation. Cependant, ce complexe a divers rôles dans le contrôle de la traduction qui s’étendent au-delà de la deadenylation29. Nous souhaitions tester l’expression de Cnot1 en raison de l’importance du complexe CNOT pour la régulation de l’ARNm et des observations précédentes selon lesquelles Cnot1 interagit avec Bicc120,30. Pour analyser l’expression de Cnot1, nous avons utilisé un anticorps qui reconnaît la protéine endogène Cnot1. Il a identifié deux protéines à 250 kDa et 270 kDa dans chaque échantillon, la taille prédite de Cnot1 (Figure 3B, troisième panneau). Ainsi, ce protocole nous permet d’identifier facilement un composant critique d’un complexe réglementaire. De plus, ces données soutiennent la capacité du protocole à identifier avec succès les protéines de haut poids moléculaire.
Pour tester davantage la généralisabilité de ces résultats, nous avons ensuite analysé des échantillons pour détecter la présence d’une hélicase DEAD-box proéminente impliquée dans la répression traductionnelle, l’hélicase DEAD-box 6 (Ddx6, précédemment connue sous le nom de xp54 chez Xenopus et me31b chez la drosophile). Ddx6 est un composant important des granules de ribonucléoprotéines, est impliqué dans le stockage de l’ARNm et interagit avec Bicc1 et Cnot1 6,31,32. Un anticorps reconnaissant l’endogène Ddx6 a identifié une protéine d’environ 54 kDa dans chaque échantillon (Figure 3B, quatrième panneau). L’expression a été réduite chez les embryons zygotiques (Figure 3B, comparer les voies 5 et 6 à 1-4), comme indiqué précédemment33.
Enfin, pour nous assurer que les différences observées entre les échantillons étaient dues à des différences d’expression, nous avons décapé et sondé à nouveau l’immunotransfert avec un anticorps reconnaissant l’enzyme glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (Gapdh). Gapdh sert de « contrôle de charge » exprimé partout. Des niveaux équivalents d’expression de Gapdh confirment la coloration de Ponceau : une quantité égale de protéines totales est analysée dans les échantillons (Figure 3B, cinquième panneau).
L’ensemble de ces résultats confirme l’efficacité de cette méthode d’immunoblot. Nous avons été en mesure d’identifier des Bicc1 exogènes et endogènes à travers plusieurs stades de développement de X. laevis pertinents pour l’étude des interactions ARN-protéines : les ovocytes et les embryons pré-MBT, qui ne contiennent que des ARNm déposés maternellement, et les embryons post-MBT, qui comprennent également des ARNm transcrits zygotement. Nous avons pu généraliser ces résultats en analysant l’expression de plusieurs protéines de contrôle traductionnel à une variété de poids moléculaires (Bicc1, Cnot1 et Ddx6) et à un contrôle de charge (Gapdh). Nous montrons également que ce protocole peut être utilisé pour les embryons de X. tropicalis avec une modification pour augmenter la quantité de matériel utilisée pour tenir compte de leur plus petite taille (Figure supplémentaire 1).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69139/69139fig3.jpg"> 
Figure 3 : Identification des niveaux de protéines régulatrices traductionnelles par immunotransfert chez X. laevis. (A) Coloration Ponceau de l’immunoblot pour identifier la protéine totale des ovocytes de stade VI, des embryons de stade 7 et des embryons de stade 10,5 de X. laevis. Chaque voie représente 10 % de la protéine préparée à partir d’un extrait (0,5 ovocyte ou embryon). (B) Analyse par immunotransfert de protéines régulatrices translationnelles sélectionnées de X. laevis dans les ovocytes de stade VI, les embryons de stade 7 et les embryons de stade 10.5. Les voies 2, 4 et 6 correspondent à des échantillons micro-injectés d’ARNm HA-Bicc1 avant l’analyse, tandis que les voies 1, 3 et 5 servent de témoins négatifs (non injectés). L’anticorps α-Bicc1 a été utilisé pour tester l’expression de Bicc1 endogène à travers les étapes (panneau du haut). Le transfert a ensuite été décapé et sondé à nouveau avec un anticorps contre l’étiquette d’affinité HA comme contrôle de la spécificité de l’anticorps α-Bicc1 (deuxième panel). Des transferts ont été retirés et sondés à nouveau pour trouver des protéines régulatrices supplémentaires à l’aide de α-Cnot1 (troisième panneau) et de α-Ddx6 (quatrième panneau). α-Gapdh (panneau inférieur) a servi de contrôle pour une charge protéique égale. Les pointes de flèches rouges marquent l’emplacement de Bicc1 endogène, tandis que les pointes de flèches noires marquent l’emplacement du terme C HA-Bicc1 exprimé de manière exogène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/69139fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Analyse immunoblot de la protéine Bicc1 chez Xenopus laevis par rapport à Xenopus tropicalis. L’anticorps anti-Bicc1 α-Bicc1 a été utilisé pour tester l’expression de Bicc1 endogène et exogène dans différentes quantités d’extrait d’embryon de X. laevis et de X. tropicalis . Couloir 1 : 0,5 embryon de X. laevis non injecté. Voie 2 : 0,5 HA-Bicc1 injecté d’embryon de X. laevis . Couloir 3 : 3 embryons de X. tropicalis non injectés. Couloir 4 : 1 embryon de X. tropicalis non injecté. Couloir 5 : 0,5 embryon de X. tropicalis non injecté. Deux anticorps reconnaissant Bicc1 endogène ont été utilisés : l’un contre Bicc1 humain (panneau supérieur) et l’autre contre X. laevis Bicc1 (panneau central). α-Gapdh (panneau inférieur) a été utilisé pour contrôler la charge égale en protéines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69139/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Analyse optimisée des protéines des ovocytes et des embryons de xénope par immunobuvardage

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