Analyse optimisée des protéines des ovocytes et des embryons de xénope par immunobuvardage

Au cours de la vie d’un animal, des décisions relatives aux sulfates se produisent continuellement, ce qui permet un développement normal et la santé d’un organisme adulte. Ces décisions dépendent de protéines spécifiques référencées aux régulateurs de sulfate. L’objectif de notre recherche est de trouver les mécanismes qui contrôlent la synthèse de ces régulateurs critiques.

En plus de fournir un aperçu détaillé de l’immunobuvardage et des ovocytes et embryons de xénope, notre protocole donne un aperçu des défis communs à cet organisme modèle, tels que l’approvisionnement en anticorps. Grâce à une étude approfondie des mécanismes de liaison et de répression de Bicaudal C, notre recherche a permis d’établir une base d’informations permettant de comparer d’autres régulateurs translationnels. Pour commencer le traitement des cellules pour l’immunobuvardage, ajoutez 10 microlitres de tampon de lyse cellulaire réfrigéré dilué à une concentration unique avec de l’eau désionisée double par embryon ou ovocyte.

À l’aide d’un micropilon, homogénéisez les échantillons sur de la glace. Placez les tubes dans une centrifugeuse de paillasse et faites tourner les échantillons à 5 000 g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer les débris de granules, y compris le jaune d’œuf et les pigments insolubles. Transférez le surnageant dans un tube propre de 1,5 millilitre, en veillant à ce que la pastille ne soit pas dérangée pendant le transfert.

Ajouter un volume égal de tampon d’échantillon deux fois Laemmli complété par 5 % en poids de 2-mercaptoéthanol en volume au surnageant collecté. Chauffez le mélange à 95 à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dénaturer les protéines. Maintenant, retirez un gel préfabriqué bis-tris SDS de 4 à 12 % de son emballage et décollez l’autocollant du bas du gel.

Insérez le gel dans l’ensemble d’électrodes situé à l’opposé d’un barrage tampon et placez l’ensemble dans un réservoir d’électrophorèse vertical. Ensuite, remplissez à la fois l’ensemble d’électrodes et le fond du réservoir avec le tampon de fonctionnement Tris-MOPS-SDS. Retirez délicatement le peigne de gel et la pipette qui fait couler le tampon dans les puits pour éliminer les bulles et équilibrer le tampon.

Maintenant, chargez cinq microlitres d’étalons de protéines pré-colorés dans le premier puits et 10 microlitres de chaque échantillon préparé dans les puits restants. Placez le couvercle sur le réservoir d’électrophorèse et connectez-le à une source d’alimentation. Ensuite, réglez la tension sur 200 volts pour initier l’électrophorèse.

Arrêtez l’électrophorèse une fois que le front du colorant du tampon d’échantillon sort du gel. Avant la fin de l’électrophorèse, commencez à assembler le sandwich de transfert dans le clip de transfert. Remplissez un plat de cuisson en verre avec un tampon de transfert réfrigéré et immergez tous les matériaux de transfert dans ce tampon pendant l’assemblage.

Placez le clip de transfert dans le plat avec la moitié noire posée contre le fond, la moitié blanche pointée vers le haut et le clip ouvert vers la gauche. Posez une ou deux éponges en fibres à plat sur la moitié noire du clip de transfert. Après avoir coupé deux morceaux de papier de chromatographie cellulosique de 0,35 millimètre à la bonne taille, placez-en un sur les éponges.

Une fois l’électrophorèse terminée, retirez le gel du réservoir d’électrophorèse. À l’aide du levier d’ouverture de la cassette de gel, séparez soigneusement les plaques de gel, tout en vous assurant que le gel reste fixé d’un côté. Coupez les puits par le haut du gel à l’aide du libérateur de gel.

Placez le gel, toujours attaché à une moitié de la cassette en plastique, sur le papier filtre, et retirez la moitié restante de la cassette pour que le gel reste à plat sur le papier. Ensuite, coupez un morceau de membrane nitrocellulosique de 0,45 micromètre pour correspondre aux dimensions du gel. Retirez la membrane de son papier de protection, mouillez-la brièvement dans un tampon de transfert et placez-la soigneusement sur le gel.

Ensuite, posez un deuxième morceau de papier filtre sur la membrane de nitrocellulose. À l’aide d’un rouleau, appuyez doucement mais fermement sur toutes les bulles d’air. Empilez une ou deux éponges en fibres supplémentaires sur le papier filtre pour compléter le sandwich.

Fermez la cassette de transfert et fixez-la bien pour sceller le sandwich assemblé. Ensuite, insérez le sandwich de transfert fermé dans le noyau de transfert avec le clip vers le haut, et assurez-vous que le côté noir du clip fait face au côté noir du noyau. Placez le noyau de transfert dans le réservoir d’électrophorèse.

Ajoutez un sac de glace et une barre d’agitation dans le réservoir, en veillant à ce que la barre d’agitation puisse tourner librement. Remplissez le réservoir avec un tampon de transfert réfrigéré jusqu’à ce que l’appareil soit complètement immergé et fixez le couvercle sur le dessus. Connectez l’appareil à l’alimentation électrique, faites correspondre les couleurs des électrodes et réglez les conditions sur 100 volts pendant une heure avec la barre d’agitation en rotation.

Une fois le transfert terminé, ouvrez délicatement la cassette et démontez le sandwich. Retirez la membrane de nitrocellulose et marquez le côté qui a été en contact avec le gel. Ensuite, placez la membrane de nitrocellulose dans un petit récipient de manière à ce qu’elle repose à plat contre le fond.

Recouvrez complètement la membrane de teinture Ponceau et balancez-la doucement sur une bascule pendant 5 à 10 minutes. Après avoir versé la tache de Ponceau, rincez la membrane plusieurs fois avec de l’eau double désionisée jusqu’à ce que l’excès de teinture soit éliminé et que des bandes de protéines deviennent visibles dans les allées. Ensuite, effectuez les étapes de blocage de la membrane, d’incubation d’anticorps et de lavage comme indiqué.

Une fois l’incubation et le lavage de l’anticorps secondaires terminés, la membrane est prête pour l’imagerie. Dans une pièce sombre, allumez le révélateur de film et laissez-le se réchauffer. Coupez deux carrés de pellicule plastique assez grands pour couvrir entièrement la membrane.

À l’aide d’une pince, placez la membrane de nitrocellulose face vers le haut sur le premier carré de pellicule plastique. Dans un tube de 1,5 millilitre, mélangez des volumes égaux de luminol de chimiluminescence améliorée et de réactifs d’amplification. Ensuite, utilisez environ un millilitre du mélange pour couvrir la plupart des membranes.

À l’aide de la pellicule plastique, manipulez doucement la membrane pour vous assurer que toute la surface est uniformément recouverte et incubez pendant une minute. Ensuite, retirez l’excès de réactif ECL en saisissant la membrane avec une pince et en secouant légèrement le liquide. Placez la membrane face vers le haut sur le deuxième carré de pellicule plastique, pliez-la sans serrer sur la membrane et collez solidement l’enveloppe dans une cassette d’autoradiographie.

Ensuite, imagez la membrane à l’aide d’un film d’autoradiographie dans une pièce sombre en suivant les étapes indiquées. Une fois la visualisation des protéines souhaitée obtenue, alignez le film développé avec les marqueurs phosphorescents et utilisez-les comme guide pour marquer la position des étalons de protéines pré-colorés sur le film. Une fois l’imagerie terminée, retirez soigneusement la membrane de la pellicule plastique et plongez-la dans du TBSTW pour éliminer le réactif ECL résiduel.

La coloration Ponceau de la membrane a confirmé le transfert réussi de protéines. La protéine B1 endogène n’a pas été détectée dans les échantillons d’ovocytes, mais a été clairement détectée dans les échantillons d’embryons de stade sept et 10,5 à environ 107 kilodaltons. Une bande protéique plus petite de 70 kilodaltons a été détectée dans des échantillons injectés à tous les stades à l’aide de l’anticorps Bicc1, indiquant une expression réussie de la fusion C-terminale HA-Bicc1.

L’anticorps HA a détecté la même bande de 70 kilodaltons uniquement dans les échantillons injectés, confirmant la spécificité de l’anticorps Bicc1 pour la protéine de fusion. Deux bandes de poids moléculaire élevé, d’environ 250 et 270 kilodaltons, ont été détectées dans tous les échantillons utilisant l’anticorps CNOT1. L’expression de la protéine DDX6 de 54 kilodaltons a été détectée dans tous les échantillons, mais elle a été visiblement réduite chez les embryons de stade 10,5.