Préparation et traitement des artères calcifiées avec morphologie et ARN préservés pour le profilage spatial numérique

La transcriptomique spatiale offre un avantage sur le séq à ARN unicellulaire et le séq à ARN en masse en préservant l’information spatiale dans le tissu. En utilisant des outils comme RNAscope, la déconvolution computationnelle et des ensembles de données unicellulaires accessibles publiquement, il est possible de cartographier le comportement cellulaire à ses profils de niche et de gènes, et de construire une vue intégrée de la biologie tissulaire. Cette technologie explose.

Deux articles de mai 2025 dans Nature se concentrent sur des études de transcriptomie spatiale. Si l’on suit PubMed, la courbe est encore plus raide : environ 150 articles spatiaux en 2023, près de 300 en 2024, et en voie de dépasser les 500 publications en 2025. La transcriptomique spatiale a déjà remodelé plusieurs grands domaines de recherche, tels que la biologie du cancer, les neurosciences, l’immunologie et la biologie du développement.

Pourtant, la biologie vasculaire est en retard. L’hétérogénéité et la géométrie unique des artères et veines les rendent difficiles pour l’attachement tissulaire et la préservation de l’ARN. De plus, les lésions vasculaires avancées présentent une calcification et une thrombose, qui réduisent encore l’intégrité tissulaire.

Ce protocole est spécifiquement conçu pour les structures de type vaisseau. Nous incluons également des méthodologies pour réduire le coût et les processus de coloration nécessaires pour évaluer l’ARN, le dépôt de calcium et les cellules d’intérêt. Compte tenu de la rareté actuelle des études de transcriptomique spatiale axées sur les vasculaires comparé à d’autres domaines, ce protocole est conçu pour être économique et accessible aux débutants, offrant aux chercheurs vasculaires des outils accessibles pour adopter la transcriptomique spatiale dans leurs études.

Ce protocole est également potentiellement utile pour de grands échantillons de cohortes pour des expériences cliniques. Dans ce protocole, nous décrivons des procédures détaillées couvrant la manipulation soigneuse des tissus artères calcifiés, les méthodes de calcification des propriétés visant à préserver la qualité de l’ARN et la morphologie tissulaire, les techniques de coloration pour la vérification et le guidage lors de la sélection du ROI, ainsi que la coloration finale des marqueurs morphologiques sur des lames préparées, afin de garantir qu’elles sont prêtes à être traitées sur l’instrument numérique de profilage spatial. Les artères tibiales humaines, y compris les artères tibiale antérieure, tibiale postérieure et périnéale, ont été prélevées à partir d’échantillons d’amputation de patients et stockées dans du DMEM contenant 1 % HEPES et 1 % Pen-Streptococi.

Chaque artère est transférée dans une boîte de Petri de 100 millimètres avec le milieu. L’excès de tissu conjonctif périvasculaire est retiré à l’aide de ciseaux stériles et de pinces, ne laissant que la paroi artérielle. L’artère coupée est transférée dans une nouvelle boîte de Petri.

Une planche à découper stérile est préparée à l’intérieur du plat. Les artères sont découpées en segments d’un centimètre à l’aide d’une lame chirurgicale. Deux segments de chaque artère sont congelés instantanément dans des cryotubes dans de l’azote liquide pour la cryoconservation et le stockage en vue de futurs travaux sur les protéines ou l’ARN.

Les segments restants sont placés dans des tubes de 15 millilitres contenant du formol tamponné neutre à 10 % et fixés à quatre degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. La solution de décalcification contenant 10 % d’EDTA dans une solution stabilisatrice d’ARN est préparée, ajustant le pH à 5,2 pour la solution de travail. Les tissus fixés sont transférés dans une nouvelle antenne contenant du PBS, et les mouchoirs sont brièvement lavés.

Chaque échantillon est transféré dans un tube de 15 millilitres contenant une solution de décalcification et agité à quatre degrés Celsius pendant 72 heures. Après la décalcification, les échantillons sont lavés deux fois à l’aide de PBS avec une agitation douce pendant cinq minutes. Les tissus sont transférés dans des cassettes.

Les cassettes sont placées dans un processeur de tissu. Le traitement du formol est effectué pendant au moins quatre heures. Le temps peut varier selon la matrice d’échantillon.

Plusieurs segments d’artère sont placés par bloc. Le bloc est rempli de paraffine et laissé refroidir complètement. Les lames sont préparées en marquant la zone de tissu restreinte sur le dos des lames.

Confirmez que tous les segments se trouvent dans la zone restreinte requise par l’instrument DSP GeoMx. L’excès de paraffine est étalé des blocs. Les blocs sont ensuite coupés en cinq microns avec des lames à profil bas.

Les rubans de tissu sont montés dans la zone marquée. Au moins quatre sections sérielles par bloc sont montées pour différentes colorations dans l’expérience DSP. Conservez les lames à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Ensuite, une hybridation in situ par RNAscope, ainsi qu’une coloration histologique, sont réalisées sur des lames préparées en série. De plus, un autre ensemble de lames est coloré avec des marqueurs morphologiques, tels que CD45 pour les cellules immunitaires et l’alpha-SMA pour les cellules musculaires lisses. La procédure d’hybridation in situ de l’ARNscope comprend brièvement quatre étapes principales : la cuisson des lames en prétraitement, la déparaffinisation et la réhydratation standard, la récupération de la cible, l’hybridation par sonde avec amplification du signal et la coloration des colorants pour la visualisation de l’ARN.

Pour la validation histologique, la coloration H&E et la coloration Alizarin Red S sont réalisées afin de permettre une localisation précise des dépôts calciques. Enfin, la coloration morphologique des marqueurs est réalisée selon un protocole immunohistochimique standard pour identifier les cellules d’intérêt, guidant ainsi la sélection du ROI. Dans cette étude, deux protocoles basés sur l’EDTA ont été comparés : l’un, 10 % d’EDTA seul pendant 72 heures, et deux, une solution stabilisante à 10 % d’EDTA et d’ARN pour la même durée.

La morphologie et la qualité de l’ARN ont été évaluées par hybridation in situ par ARNscope. Les deux méthodes ont préservé l’architecture des vaisseaux, mais les lames traitées avec l’EDTA et le cocktail de solutions stabilisatrices d’ARN ont montré des signaux d’ARN nettement plus forts, comme démontré dans le panneau de droite, indiquant que la solution stabilisante d’ARN protège les transcriptes tandis que l’EDTA chélate le phosphate de calcium cristallin et ramollit progressivement l’échantillon sans activer les RNases. Avec la stratégie de préservation de l’ARN optimisée et la qualité confirmée, nous démontrons les étapes de coloration histologique pour le dépôt de calcium à l’aide d’hématoxyline, d’éosine et d’alizarine rouge S. L’alizarine lie sélectivement les sels ioniques de calcium et change de teinte de l’orange au rouge brique, mettant en évidence sensiblement les micro et macro calcifications, bien qu’elle fournisse moins de détails cellulaires et extracellulaires que H&E.

L’utilisation des deux colorations maximise l’information structurelle et compositionnelle. Après la coloration morphologique par marqueurs, les diapositives sont numérisées sur la plateforme GeoMx. L’anticorps CD45 marque les cellules immunitaires, tandis que l’actine du muscle lisse alpha marque les cellules lisses vasculaires abondantes dans le milieu.

Les ROI sélectionnés comprennent environ 100 à 150 noyaux avec un rendement d’ARN suffisant. Les ROI ont été placés à proximité et à distance des zones calcifiées afin de comparer les schémas d’expression génique spatiale pertinents pour la calcification médiale de l’artère tibiale. Malgré une certaine perte tissulaire lors des étapes de traitement de plusieurs heures, plusieurs ROI appropriés ont été identifiés dans chaque section artérielle.

Pour conclure, ce flux de travail couvre la manipulation des tissus artères calcifiés et la décalcification par validation et sélection du ROI pour une étude de transcriptomique spatiale. En particulier, combiner H&E avec une coloration spécifique à l’alizarine au calcium assure une localisation précise de la calcification vasculaire et maximise à la fois les informations structurelles et compositionnelles pour le placement du ROI. L’analyse ARNscope montre que les sections artérielles décalcifiées restent en grande partie intactes avec suffisamment d’ARN.