Name: Shrinky-gouttes pendantes Dink: une façon simple de formulaire et de la Culture corps embryoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Apprenez une méthode simple et rapide pour charger un nombre prédéfini de cellules dans des micropuits et former des corps embryonnaires. Cette technique améliore la reproductibilité des expériences en biologie des cellules souches.

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Nous tenons à remercier le CIRM pour le soutien de ce travail. La lignée cellulaire a été généreusement donnés par le Dr Andras Nagy à l&#39;Hôpital Mount Sinai, à Toronto, en Ontario.

1. Faire Shrinky-Mold Dink <ol><li> Imprimez le motif désiré sur Shrinky-dink feuille en utilisant une imprimante de bonne définition. </li><li> Cuire Shrinky-dink feuille à 163 ° C pendant environ 10 minutes, ou jusqu&#39;à ce que tout rétréci et ayant acquis une forme régulière. </li><li> Après Shrinky-dink moule a refroidi, le plonger dans un bain d&#39;isopropanol jusqu&#39;à ce que la surface totale est à peine couverts. </li><li> Soigneusement, vaporiser un peu d&#39;acétone sur le moule et secouer le récipient à quelques reprises. Ajouter plus d&#39;isopropanol pour laver l&#39;excès d&#39;acétone et de répéter cette étape plusieurs fois jusqu&#39;à Shrinky-moisissure semble propre. </li><li> Moisissures Plonger dans l&#39;eau distillée pendant 10 minutes pour se laver de toute restantes solvant organique. </li><li> Air propre Shrinky-moule. Il a reconduit la chaleur pendant environ 5 minutes à 163 ° C. Ce sera d&#39;encre compacte et évaporer tout solvant restant. </li></ol> 2. Faire PDMS micropuits <ol><li> Préparer un mélange 10:01 PDMS agent / durcissement, et agiter vigoureusement pendant quelques minutes. </li><li> Placez-Shrinky Dink moule dans une petite boîte de Petri. Verser le mélange PDMS jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne environ 1 / 2 cm sur la surface du moule. </li><li> Placer sous le plat de cloche à vide pour éliminer toutes les bulles du mélange PDMS. </li><li> Plat Mettre au four à 70 ° C, pendant la nuit. </li><li> Coupez solides PDMS par la moisissure et le lier à une lame de verre simplement en appliquant une pression. </li><li> Jeter premier micropuits puce, car il a les résidus d&#39;encre incrustée entre le PDMS. </li><li> Répétez cette procédure pour produire une seconde puce qui est sans encre et a une forme plus définie. </li><li> Nettoyer micropuits-puce en utilisant une solution d&#39;éthanol à 70%. Placez-le sous source de lumière UV pendant 10 minutes pour le stériliser. </li></ol> 3. Le piégeage des cellules dans des micropuits <ol><li> Comptez les cellules et les diluer dans des milieux de culture à la concentration souhaitée (selon le nombre de cellules initiales dans les puits que vous souhaitez). Par exemple, pour obtenir environ 10-15 cellules par puits (moyenne = 11, SD = 5,4, le taux de chargement = 93%), nous avons utilisé une concentration de 8 x 10 4 cellules / ml. Pour une concentration de 17 × 10 4 cellules / ml, on pouvait obtenir de manière fiable entre 25 et 35 cellules par puits (moyenne = 27,17857 SD = 7,7, le taux de chargement = 100%). </li><li> Placez délicatement puce micropuits dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant une base de PDMS solidifié. </li><li> Ajouter environ 2JDP ml de la solution de la cellule. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 760 rpm et 4 ° C. </li><li> Pipet à l&#39;excès de solution et les laver soigneusement avec du PBS 1X micropuits solution. </li><li> Placer dans un plat à micropuits Petry petits, en faisant attention tout en prenant la puce hors du tube de centrifugation. </li><li> Lavez l&#39;excès de cellules en utilisant une solution de PBS X. </li><li> Placez puce micropuits sous un microscope inversé à vérifier le numéro de l&#39;intention de cellules par puits. </li><li> Incuber micropuits contenant des cellules dans des conditions standard. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Figure-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Incubation des cellules <ol><li> Suivre le protocole EB normale dans le laboratoire. </li><li> Changer le support lentement du côté de la chambre; éviter de perturber la cellule dans le puits. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué (moulés à partir de Shrinky-Dinks) et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d&#39;expérimentation. Cette méthode se prête à n&#39;importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié, parce que nous parer à la nécessité pour la photolithographie. Nous pouvons varier la taille des ...

Pour les médias MESC (McCloskey laboratoire de protocole): (pour les médias totale préparée: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7,5 ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM de L-glutamine: 0,5 ml; 1ml NEAA: 0,5 ml; 1ml FRV: 100 ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul dilué BME:. 50ul; 100ul (Ajouter 35ul de BME filtrée stérile pour 5ml de PBS et de seringues stériliser par filtration Jeter après 2 semaines. concentration finale dans la solution est 0,1 mM)

shrinky-gouttes pendantes dink: une façon simple de formulaire et de la culture corps embryoïdes

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Corps embryoïdes (EB) sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La façon la plus commune de créer ces agrégats est la méthode la goutte suspendue, une approche laborieuse de pipetage un nombre arbitraire de cellules dans des plaques bien. Les interactions entre les cellules souches contraints à proximité les uns des autres favorise la génération de l&#39;EBS. Parce que les médias dans chacun des puits doit être manuellement échangés chaque jour, cette approche est manuellement intensives. Par ailleurs, parce que les paramètres environnementaux, y compris cellule-cellule, les interactions de facteurs cellulaires solubles, le pH, l&#39;oxygène et la disponibilité peuvent être des fonctions de la taille de EB, les populations cellulaires obtenues à partir traditionnelle gouttes suspendues peut varier considérablement, même quand elles sont cultivées dans des conditions identiques. Des études récentes ont en effet montré que le nombre initial de cellules formant l&#39;agrégat peut avoir des effets significatifs sur la différenciation des cellules souches. Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d&#39;expérimentation. Cette méthode se prête à n&#39;importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié. Nous démontrons cette méthode en créant des corps embryoïdes en utilisant une ligne rouge fluorescente de cellules de souris (129S6B6-F1).

Nous montrons une méthode simple et rapide à charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes.

Shrinky-gouttes pendantes Dink: une façon simple de formulaire et de la Culture corps embryoïdes

Les corps embryoïdes (EB) sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La méthode la plus courante pour créer ces agrégats est la technique de la goutte suspendue, un procédé laborieux...

Les embryocorps sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La méthode la plus courante pour créer ces agrégats est la méthode de la goutte pendante. Une approche laborieuse consistant à pipeter un nombre arbitraire de cellules dans des puits de plaques.Le processus est intensif en main-d'œuvre, car il faut changer manuellement le milieu et chaque plaque de puits chaque jour. De plus, des études récentes ont montré que le nombre initial de cellules formant l'agrégat peut influencer la différenciation des cellules souches. Cette méthode ne permet pas de prédéterminer le nombre de cellules.Dans cette vidéo, nous montrons une méthode simple et rapide pour charger différents nombres de cellules dans des puits microfabriqués destinés au développement de corps en broderie. Bonjour, je suis Jonathan Pagan du laboratoire de Michelle K à l'École de génie de l'Université de Californie à Merced, et je suis Jesus Luna, également du laboratoire de K. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de créer des corps en broderie dans des puits microfabriqués à l'aide d'une centrifugation.Cette procédure comprend les étapes suivantes : la création d'un dispositif microsc

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Cette vidéo montre comment effectuer la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris aux corps embryoïdes utilisant la méthode de la goutte pendante.

Différenciation in vitro de souris embryonnaires souches (MES) Cellules utilisant la méthode de goutte suspendue

Nous décrivons une méthode simple et rapide de générer des tissus 3D-like sphéroïdes et leur application potentielle de quantifier les différences dans les interactions cellule-cellule.

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Cette vidéo montre un test permettant de générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Les iPSC humaines sont amenées à former des corps embryoïdes (EB). Les EB sont cultivés sur un échafaudage polymère à l’aide d’un milieu d’induction, favorisant la différenciation en cellules souches neurales, cellules progénitrices et neurones immatures. Enfin, les EB sont intégrés dans une matrice et transférés dans un milieu d’entretien pour la formation...

Génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Cette vidéo montre le processus de génération de boules de neurones à l’aide d’une technique de culture de gouttes suspendues. À l’intérieur des gouttes suspendues, les cellules se déplacent vers le bas, s’auto-assemblées en structures tridimensionnelles formant des boules de neurones, qui peuvent être utilisées pour des études neurobiologiques.

Développement de boules de neurones à l’aide d’une technique de culture de gouttes suspendues

La vidéo démontre la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (CSEm) en corps embryoïdes (EB) par la méthode de la goutte suspendue. Lors de la suspension des CSEm dans des gouttes suspendues et de l’incubation, les cellules s’agrègent pour former des EB, qui sont ensuite différenciées en cellules progénitrices neuronales (NPC) à l’aide d’un milieu de différenciation complété par de l’acide rétinoïque (AR).

Génération de progéniteurs neuraux à partir de cellules souches embryonnaires de souris par la méthode de la goutte suspendue

Cette vidéo démontre le processus de différenciation des corps embryoïdes (EB) en agrégats neuroépithéliaux et leur division ultérieure en cellules neuronales et gliales. Cette méthode permet de générer efficacement des cellules neuronales et gliales in vitro, qui servent de systèmes d’essai pour les tests de toxicité ainsi que pour l’évaluation des différentes voies impliquées dans la neurotoxicité.

Génération de neurones et de cellules gliales à partir de corps embryoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Cette vidéo présente l’utilisation d’une technique d’éclairage latéral à lumière douce pour améliorer la visualisation à l’œil nu des corps embryoïdes, facilitant ainsi leur manipulation et leur transfert lors de la culture d’organoïdes cérébraux. Il élucide la configuration de l’éclairage à lumière douce, des méthodes de changement de milieu et de transfert de corps embryoïde, ainsi que la procédure d’induction de la différenciation neuronale dans les corps embryoïdes pour le développement des...

Technique d’optimisation de la culture d’organoïdes cérébraux à l’aide d’un éclairage latéral à lumière douce

La culture de gouttelettes verticales ex vivo est une alternative aux techniques expérimentales in vitro et in vivo actuelles. Ce protocole est facile à réaliser et nécessite de plus petites quantités de réactif, tout en permettant de manipuler et d’étudier la vascularisation, la morphogenèse et l’organogenèse du fœtus.

Utilisation<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

Nous décrivons une technique pour l'utilisation de cellules souches embryonnaires de souris pour générer deux ou trois dimensions des corps embryoïdes. Nous expliquons alors comment induire la différenciation neuronale des cellules du corps embryoïdes par l'acide rétinoïque, et comment analyser leur état de différenciation par immunofluorescence marqueur de cellules progénitrices et immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh). Ce protocole génère des organoïdes rénaux en deux semaines. Les organoïdes rénaux qui en résultent peuvent être cultivés dans des flacons de spinner à grande échelle ou des plaques d’agitation magnétiques multi-puits pour des approches parallèles de test de drogues.

Une méthode simplifiée pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Ici, nous présentons un protocole complet pour la génération et l’analyse en aval d’organoïdes cérébraux humains à l’aide du séquençage de l’ARN unicellulaire et mononucléique.

Génération et analyse en aval de transcriptomes unicellulaires et mononucléiaux dans des organoïdes cérébraux

Apprenez une méthode simple et rapide pour charger un nombre prédéfini de cellules dans des micropuits et former des corps embryonnaires. Cette technique améliore la reproductibilité des expériences en biologie des cellules souches.

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