Name: Shrinky-gouttes pendantes Dink: une façon simple de formulaire et de la Culture corps embryoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Apprenez une méthode simple et rapide pour charger un nombre prédéfini de cellules dans des micropuits et former des corps embryonnaires. Cette technique améliore la reproductibilité des expériences en biologie des cellules souches.

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Nous tenons à remercier le CIRM pour le soutien de ce travail. La lignée cellulaire a été généreusement donnés par le Dr Andras Nagy à l&#39;Hôpital Mount Sinai, à Toronto, en Ontario.

1. Faire Shrinky-Mold Dink <ol><li> Imprimez le motif désiré sur Shrinky-dink feuille en utilisant une imprimante de bonne définition. </li><li> Cuire Shrinky-dink feuille à 163 ° C pendant environ 10 minutes, ou jusqu&#39;à ce que tout rétréci et ayant acquis une forme régulière. </li><li> Après Shrinky-dink moule a refroidi, le plonger dans un bain d&#39;isopropanol jusqu&#39;à ce que la surface totale est à peine couverts. </li><li> Soigneusement, vaporiser un peu d&#39;acétone sur le moule et secouer le récipient à quelques reprises. Ajouter plus d&#39;isopropanol pour laver l&#39;excès d&#39;acétone et de répéter cette étape plusieurs fois jusqu&#39;à Shrinky-moisissure semble propre. </li><li> Moisissures Plonger dans l&#39;eau distillée pendant 10 minutes pour se laver de toute restantes solvant organique. </li><li> Air propre Shrinky-moule. Il a reconduit la chaleur pendant environ 5 minutes à 163 ° C. Ce sera d&#39;encre compacte et évaporer tout solvant restant. </li></ol> 2. Faire PDMS micropuits <ol><li> Préparer un mélange 10:01 PDMS agent / durcissement, et agiter vigoureusement pendant quelques minutes. </li><li> Placez-Shrinky Dink moule dans une petite boîte de Petri. Verser le mélange PDMS jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne environ 1 / 2 cm sur la surface du moule. </li><li> Placer sous le plat de cloche à vide pour éliminer toutes les bulles du mélange PDMS. </li><li> Plat Mettre au four à 70 ° C, pendant la nuit. </li><li> Coupez solides PDMS par la moisissure et le lier à une lame de verre simplement en appliquant une pression. </li><li> Jeter premier micropuits puce, car il a les résidus d&#39;encre incrustée entre le PDMS. </li><li> Répétez cette procédure pour produire une seconde puce qui est sans encre et a une forme plus définie. </li><li> Nettoyer micropuits-puce en utilisant une solution d&#39;éthanol à 70%. Placez-le sous source de lumière UV pendant 10 minutes pour le stériliser. </li></ol> 3. Le piégeage des cellules dans des micropuits <ol><li> Comptez les cellules et les diluer dans des milieux de culture à la concentration souhaitée (selon le nombre de cellules initiales dans les puits que vous souhaitez). Par exemple, pour obtenir environ 10-15 cellules par puits (moyenne = 11, SD = 5,4, le taux de chargement = 93%), nous avons utilisé une concentration de 8 x 10 4 cellules / ml. Pour une concentration de 17 × 10 4 cellules / ml, on pouvait obtenir de manière fiable entre 25 et 35 cellules par puits (moyenne = 27,17857 SD = 7,7, le taux de chargement = 100%). </li><li> Placez délicatement puce micropuits dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant une base de PDMS solidifié. </li><li> Ajouter environ 2JDP ml de la solution de la cellule. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 760 rpm et 4 ° C. </li><li> Pipet à l&#39;excès de solution et les laver soigneusement avec du PBS 1X micropuits solution. </li><li> Placer dans un plat à micropuits Petry petits, en faisant attention tout en prenant la puce hors du tube de centrifugation. </li><li> Lavez l&#39;excès de cellules en utilisant une solution de PBS X. </li><li> Placez puce micropuits sous un microscope inversé à vérifier le numéro de l&#39;intention de cellules par puits. </li><li> Incuber micropuits contenant des cellules dans des conditions standard. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Figure-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Incubation des cellules <ol><li> Suivre le protocole EB normale dans le laboratoire. </li><li> Changer le support lentement du côté de la chambre; éviter de perturber la cellule dans le puits. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué (moulés à partir de Shrinky-Dinks) et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d&#39;expérimentation. Cette méthode se prête à n&#39;importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié, parce que nous parer à la nécessité pour la photolithographie. Nous pouvons varier la taille des ...

Pour les médias MESC (McCloskey laboratoire de protocole): (pour les médias totale préparée: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7,5 ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM de L-glutamine: 0,5 ml; 1ml NEAA: 0,5 ml; 1ml FRV: 100 ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul dilué BME:. 50ul; 100ul (Ajouter 35ul de BME filtrée stérile pour 5ml de PBS et de seringues stériliser par filtration Jeter après 2 semaines. concentration finale dans la solution est 0,1 mM)

shrinky-gouttes pendantes dink: une façon simple de formulaire et de la culture corps embryoïdes

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Corps embryoïdes (EB) sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La façon la plus commune de créer ces agrégats est la méthode la goutte suspendue, une approche laborieuse de pipetage un nombre arbitraire de cellules dans des plaques bien. Les interactions entre les cellules souches contraints à proximité les uns des autres favorise la génération de l&#39;EBS. Parce que les médias dans chacun des puits doit être manuellement échangés chaque jour, cette approche est manuellement intensives. Par ailleurs, parce que les paramètres environnementaux, y compris cellule-cellule, les interactions de facteurs cellulaires solubles, le pH, l&#39;oxygène et la disponibilité peuvent être des fonctions de la taille de EB, les populations cellulaires obtenues à partir traditionnelle gouttes suspendues peut varier considérablement, même quand elles sont cultivées dans des conditions identiques. Des études récentes ont en effet montré que le nombre initial de cellules formant l&#39;agrégat peut avoir des effets significatifs sur la différenciation des cellules souches. Nous avons développé une méthode de culture simple, rapide et évolutive pour charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes. Enfin, ces cellules sont facilement accessibles pour une analyse plus approfondie et d&#39;expérimentation. Cette méthode se prête à n&#39;importe quel laboratoire et ne nécessite aucun équipement dédié. Nous démontrons cette méthode en créant des corps embryoïdes en utilisant une ligne rouge fluorescente de cellules de souris (129S6B6-F1).

Nous montrons une méthode simple et rapide à charger pré-défini le nombre de cellules dans des puits microfabriqué et de les maintenir pour le développement du corps embryoïdes.

Shrinky-gouttes pendantes Dink: une façon simple de formulaire et de la Culture corps embryoïdes

Les corps embryoïdes (EB) sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La méthode la plus courante pour créer ces agrégats est la technique de la goutte suspendue, un procédé laborieux...

Les embryocorps sont des agrégats de cellules souches embryonnaires. La méthode la plus courante pour créer ces agrégats est la méthode de la goutte pendante. Une approche laborieuse consistant à pipeter un nombre arbitraire de cellules dans des puits de plaques.Le processus est intensif en main-d'œuvre, car il faut changer manuellement le milieu et chaque plaque de puits chaque jour. De plus, des études récentes ont montré que le nombre initial de cellules formant l'agrégat peut influencer la différenciation des cellules souches. Cette méthode ne permet pas de prédéterminer le nombre de cellules.Dans cette vidéo, nous montrons une méthode simple et rapide pour charger différents nombres de cellules dans des puits microfabriqués destinés au développement de corps en broderie. Bonjour, je suis Jonathan Pagan du laboratoire de Michelle K à l'École de génie de l'Université de Californie à Merced, et je suis Jesus Luna, également du laboratoire de K. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant de créer des corps en broderie dans des puits microfabriqués à l'aide d'une centrifugation.Cette procédure comprend les étapes suivantes : la création d'un dispositif microscopique, le chargement des cellules souches et l'alimentation des cellules souches. Commençons donc. La première étape de cette procédure consiste à fabriquer le moule en utilisant une imprimante à haute définition.Imprimez le motif souhaité sur des feuilles de rétrécissement. Ensuite, faites cuire la feuille de rétrécissement à 160 degrés Celsius pendant environ 10 minutes, ou jusqu'à ce qu'elle se soit entièrement rétractée et ait acquis une forme régulière. Après que le moule d'impression rétracté ait refroidi pendant deux minutes et soit froid au toucher.Immergez-le dans un bain d'isopropanol jusqu'à ce que la surface entière soit légèrement recouverte. Une fois que le moule d'encre rétractable a été immergé dans l'isopropanol, vaporisez soigneusement un peu d'acétone sur le moule et agitez le récipient plusieurs fois. Ajoutez ensuite davantage d'isopropanol pour éliminer l'excès d'acétone, et répétez cette étape plusieurs fois jusqu'à ce que le moule d'encre rétractable paraisse propre.Ensuite, immergez le moule et de l'eau distillée pendant 10 minutes afin d'éliminer tout solvant organique résiduel. Après cette immersion dans l'eau, séchez le moule à l'encre shrinky à l'air comprimé et réchauffez-le environ cinq minutes à 160 degrés Celsius. Ceci permettra de compacter l'encre et d'évaporer tout solvant résiduel.Et maintenant, nous pouvons passer à la fabrication des micropuits en PDMS. Nous générons maintenant les micropuits en PDMS, qui seront utilisés pour cultiver les cellules souches destinées au développement de l'embryon. Préparez un mélange de PDMS et d'agent de réticulation dans un rapport de 10 à 1 et agitez vigoureusement pendant quelques minutes.Ensuite, versez une quantité de mélange de PDMS sur le moule en shrinky dink dans une petite boîte de Pétri jusqu'à ce que l'épaisseur atteigne environ un demi-centimètre au-dessus de la surface du moule. Après avoir versé le PDMS, des bulles apparaissent souvent sur le moule ; il convient de les éliminer. Placez la boîte sous une cloche à vide pendant 20 minutes afin de supprimer toutes les bulles du mélange de PDMS.Après avoir vérifié que toutes les bulles ont été éliminées, placer la boîte au four à sept degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l'incubation, découper le PDMS solide du moule à l'aide d'une lame de rasoir. Le nettoyer à l'aide de ruban adhésif et le fixer sur une lame de verre avec les puits orientés vers le haut.Cela se fait simplement en appliquant une pression sur les bords. Ensuite, nettoyez-le à l’aide d’une solution d’éthanol à 70 % et placez-le sous une source de lumière UV pendant 10 minutes pour le stériliser.La première fois que vous faites cela, vous allez jeter le PDMS. Cela permettra d'éliminer tout résidu d'encre excédentaire de votre moule. Vous pouvez ensuite utiliser le moule tel quel.Répétez la procédure de moulage une fois de plus afin de produire une seconde puce exempte d’encre et présentant une forme plus définie. Veillez à appliquer une décharge pendant 20 secondes avant de commencer, afin de créer une surface hydrophile facilitant le chargement. Une fois les micropuits PMS fabriqués, ils peuvent désormais être utilisés pour l’étude des corps d’Enid.Procédons donc. Pour commencer, les cellules doivent être comptées et diluées dans un milieu de culture cellulaire jusqu'à la concentration souhaitée, qui dépend du nombre de cellules initiales que vous souhaitez par puits. À une concentration de 1,5 fois 10 puissance 4 cellules par millilitre, nous avons observé que chaque puits chargé contient 14 cellules par puits.Ajoutez deux millilitres de solution cellulaire dans un tube de centrifugation de 50 millilitres contenant une base de PDMS solidifiée. Placez délicatement la puce à micropuits dans le tube de centrifugation et centrifugez pendant cinq minutes à 760 tr/min. Ensuite, pipetez le milieu et placez la puce à micropuits dans une petite boîte de Pétri.Veillez à ne pas renverser le contenu lors de la sortie de la puce du tube de centrifugeuse. Placez ensuite la puce à microplaques sous un microscope inversé afin de vérifier que chaque puits est chargé. Insérez la puce dans le support et incubez les micro-puits contenant les cellules dans des conditions standard pendant 24 heures.Pour maintenir les cellules, le milieu peut être changé lentement par le côté de la chambre après 24 heures. Évitez de perturber les cellules dans le micro-puits ; vous pouvez effectuer cette opération chaque jour.Le point positif est que vous pipetez une seule fois et changez tout le milieu, contrairement à la méthode classique des gouttes suspendues où il faut renouveler le milieu pour chaque puits. Nous venons de vous montrer comment cultiver des cellules et créer des embryons à partir de moules en feuilles rétractables. Cette méthode est extrêmement utile car elle est simple, rapide et moins exigeante manuellement que la méthode de la goutte suspendue. Cette méthode ne nécessite aucune photolithographie.De plus, nous pouvons contrôler le nombre de cellules à partir desquelles nous commençons nos embryons. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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