Un modèle murin néonatal d’entérocolite nécrosante et d’isolement de la lamina propria pour le profilage des cellules immunitaires

Nos recherches portent sur la maladie qui touche les nourrissons médicalement fragiles, appelée entérocolite nécrosante. Nous visons à découvrir les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire dans la CEN et à développer des stratégies pour un diagnostic précoce et une prévention précoces de la maladie. Il est très difficile d’étudier les réponses des cellules immunitaires intestinales dans le NEC néonatal. Notre protocole comble cette lacune en démontrant comment isoler les cellules immunitaires de la lamina propre pour analyse via cytométrie en flux.

Pour commencer, prélevez une culture de bactéries entériques cultivées chez un nourrisson atteint d’entérocolite totale nécrosante, ou NEC. Le jour d’expérimentation 0 à 15h00, pipettez une aliquote de 20 microlitres de la culture dans un tube de culture de 15 millilitres contenant 2 millilitres de bouillon Luria-Bertani. Incubez la culture bactérienne à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans un vibreur orbital réglé à 1G, en veillant à ce que le couvercle du tube reste en position ventilée.

En même temps, incubez un second tube de culture contenant seulement 2 millilitres de bouillon Luria-Bertani comme témoin pour vérifier toute contamination. Le lendemain à 7h00, pipettez 125 microlitres de la culture bactérienne nocturne dans une fiole de culture cellulaire T75 avec un couvercle ventilé contenant 25 millilitres de bouillon Luria-Bertani. Préparez un total de quatre flacons T75 et incubez en position verticale à 37 degrés Celsius pendant deux heures dans un shaker orbital réglé à 1G.

À 9h00 lors des jours expérimentaux 1, 2 et 3, combinez 16 millilitres de lait infantile avec 8 millilitres de lait infantile dans un tube centrifugeuse stérile de 50 millilitres pour préparer le mélange de lait infantile. Retirez le surnageant de deux tubes centrifugeuses de 50 millilitres contenant la culture bactérienne en granules. Resuspendez soigneusement chacun des deux pellets dans 2 millilitres du mélange préparé.

Ensuite, transférez les deux mélanges en suspension dans le reste du mélange de formule pour obtenir un total de 24 millilitres de formule NEC. Étiquetez six tubes centrifugeuses de 50 millilitres avec les six points de temps d’alimentation. Pipeter 4 millilitres de la formule NEC dans chacun des six tubes étiquetés.

Ensuite, préparez six aliquotes mono-usage de stock de lipopolysaccharides à 5 milligrammes par millilitre et stockez-les dans des microtubes à faible liaison à 20 degrés Celsius. Juste avant de nourrir, décongelez un lipôle de lipopolysaccharide et utilisez un vortex pendant 15 secondes. Ajoutez un volume calculé du lipopolysaccharide à un tube de formule NEC de 4 millilitres et mélangez bien en pipettant.

Remplissez une seringue de 1 millilitre avec la formule NEC préparée et fixez-la à une ligne PICC néonatale. Pour administrer la formule NEC à chaque chiot par une gavage orale, maintenez-le doucement par la peau lâche à la base du cou et maintenez-le droit. La distance d’insertion de la ligne PICC est égale à la distance entre le coin de la bouche et le sommet de la zone laitière dans l’estomac.

Le point d’insertion optimal sur la ligne PICC doit être marqué à l’aide d’un marqueur permanent. À l’aide de pinces, guidez la ligne PICC dans l’oropharynx et descendre dans l’estomac. Si une résistance est rencontrée, retirez la ligne PICC, repositionnez-la et tentez de la réinsérer.

Distribuez lentement 80 microlitres de formule NEC dans l’estomac. Surveillez le chiot pour détecter des signes d’aspiration pendant la tétée. Après l’alimentation, retirez la ligne PICC et observez le chiot pour détecter toute respiration laborieuse ou vomissement.

En cas de régurgitation, tapez la bouche et le nez du chiot avec une lingette de laboratoire à faible teneur de peluches. Répétez le processus de repas à tous les moments de la repas. Au quatrième jour expérimental, prélèvez le tissu intestinal des souris néonatales euthanasiées.

Avec une paire de ciseaux, coupez l’intestin longitudinalement pour l’ouvrir, puis coupez-le transversalement en segments de 1 à 1,5 centimètre. Transférez les segments intestinaux dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres contenant 10 millilitres de solution de prédigestion refroidie sur glace. Ensuite, incubez le tube à 37 degrés Celsius avec une rotation continue pendant 20 minutes pour commencer la dissociation tissulaire.

Faites doucement tourner le tube pour déloger les tissus détachés, puis versez le contenu à travers une tamoire à cellules de 100 micromètres placée sur un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Transférez les fragments de tissu restants dans un nouveau tube centrifugeuse de 15 millilitres contenant 10 millilitres de solution digérative préchauffée à 37 degrés Celsius. Incubez l’échantillon en rotation continue pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, transférez le contenu dans un tube automatisé de dissociation tissulaire. Exécutez le programme avec quatre cycles de rotation alternés de 15 secondes dans les sens horaire et antihoraire. Lorsque la dissociation est terminée, il faut doucement faire passer la suspension cellulaire dans le tube de dissociation, puis centrifuger à 300G pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.

Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Resuspendez les cellules dans 1 millilitre de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence glacée. Placez une passoire à cellules de 100 micromètres sur un tube centrifugeuse de 50 millilitres.

Transférez les cellules en suspension à travers le tamis et lavez-les avec 2 millilitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence froide. Comptez les cellules isolées et évaluez leur viabilité à l’aide du bleu de trypan ou d’un colorant de viabilité. Centrifugez le volume désiré pour la cytométrie en flux à 300G pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.

Une réduction significative de la survie dans le groupe traité par NEC a été observée par rapport aux témoins alimentés par le barrage. L’examen de l’intestin macroscopal chez les souris NEC a révélé des caractéristiques caractéristiques de la CEN, notamment des signes visibles de distension, d’accumulation d’air et de pneumatose intestinale comparée à des témoins sains. La coloration par hématoxyline et éosine a révélé une destruction granulose et une architecture intestinale perturbée chez les souris NEC comparé aux villosités intactes chez les témoins.

L’expression de l’ARN messager IL1B, CXCL2 et LCN2 était significativement plus élevée dans le groupe NEC que chez les témoins. Les cellules immunitaires CD45+ totales dans la lamina proprie intestinale n’étaient pas significativement différentes entre les groupes NEC et témoins. Les niveaux de macrophages étaient significativement élevés dans les intestins de la NEC par rapport aux témoins.

Les souris NEC présentaient une proportion accrue de cellules myéloïdes, en particulier de monocytes et de macrophages, par rapport à d’autres sous-types immunitaires. Les approches multiomiques unicellulaires découvrent des signatures cellulaires immunitaires dans la NEC, offrant de nouvelles perspectives sur les mécanismes et les biomarqueurs potentiels. Modéliser la NEC est difficile car la maladie est multifactorielle.

La réplique de l’environnement intestinal humain, des réponses immunitaires et des influences microbiennes chez les souris néonatales nécessite une optimisation minutieuse. Notre modèle intègre un microbiome d’origine humaine, l’hypoxie et l’alimentation au lait infantile, ce qui le rend physiologiquement pertinent, aligné pour un profilage détaillé des cellules immunitaires chez les souris néonatales.