Imagerie de cellules vivantes du transport endocytaire à l’aide de nanocorps fonctionnalisés dans des cellules en culture

Nous étudions le trafic endocytaire et rétrograde des protéines transmembranaires ainsi que la machinerie qui confère le transport. Pour étudier le trafic protéique à la surface cellulaire, des anticorps conventionnels sont généralement utilisés, mais ils peuvent favoriser la réticulation et le ciblage lysosomal. Pour commencer, obtenez une granulée de bactéries Escherichia coli transformée avec VHH-mCherry.

Ajoutez 30 millilitres de tampon de liaison au froid glacé contenant 20 millimolaires d’imidazole dans le PBS au pellet de cellules bactériennes. Avec une pipette, resuspendez soigneusement la pellete en pipettant de haut en bas. Transférez le mélange en suspension dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres étiqueté.

Compléter les cellules en suspension avec 200 microgrammes par millilitre de lysozyme, 20 microgrammes par millilitre de DNase I, un millimolaire chlorure de magnésium et un millimolaire phénylméthylsulfonylfluorure. Après avoir incubé le tube à température ambiante pendant 10 minutes, placez-le sur un rotateur de bout en bout et poursuivez l’incubation à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, insérez une pointe solide de sonde de six millimètres directement dans la suspension de la cellule.

Perturber mécaniquement les cellules bactériennes à l’aide de trois impulsions de sonication d’une minute à 40 % d’amplitude et un cycle de travail d’une seconde allumée et une seconde éteinte. En laissant un intervalle de refroidissement d’une minute entre chaque impulsion. Après centrifugation, conservez le lysat dégagé sur la glace tout en préparant la chromatographie d’affinité métallique immobilisée à l’aide de colonnes de purification par étiquettes préemballées et à usage unique, conçues pour le fonctionnement par gravité.

Fixez les colonnes d’acide nickel-nitrilotriacétique sur un support métallique ou un support de colonne approprié. Ensuite, vide complètement le tampon de stockage de la colonne. Équilibrez la colonne en ajoutant 10 millilitres de tampon de liaison contenant 20 millimolaires d’imidazole dans le PBS.

Laissez le tampon passer par gravité. Appliquez progressivement environ 30 millilitres du lysat bactérien dégagé sur la colonne équilibrée. Laissez-le passer par gravité et écartez le flux.

Ensuite, lavez la colonne en appliquant deux volumes consécutifs de 10 millilitres de tampon de liaison contenant 20 millimolaires d’imidazole dans le PBS. Éluvez les nanocorps liés en appliquant deux millilitres de tampon d’élution contenant 500 millimolaires d’imidazole dans PBS dans un tube microcentrifuge de deux millilitres. Équilibrez une colonne de désalage ensemée dans un adaptateur de tubes de 50 millilitres en rinçant cinq fois avec cinq millilitres de PBS.

Laissez le tampon entrer complètement dans la résine compactée, puis éliminez le flux à travers. Après le rinçage final, centrifugez la colonne à 1000 x g pendant deux minutes. Déplacez maintenant la colonne avec son adaptateur sur un nouveau tube de collecte de 50 millilitres après avoir écarté le débit.

Chargez deux millilitres du nanocorps fonctionnalisé élué sur la colonne de désalage pré-équilibrée. Ensuite, centrifugez à nouveau à 1000 x g pendant deux minutes pour collecter l’éluate avant de valider l’expression et la pureté de VHH-mCherry. Lancez le logiciel du système automatisé d’imagerie cellulaire vivante.

Transférez la chambre de microscopie ibidi sur l’étage du microscope. Installez deux canaux d’imagerie à l’aide de filtres d’excitation et d’émission pour EGFP et mCherry. Choisissez un temps d’exposition court et une faible intensité d’éclairage pour éviter le blanchiment photo.

Gardez les réglages constants pour toutes les expériences. Les paramètres peuvent varier d’un journaliste à l’autre. Pour chaque condition, stockez les coordonnées de 10 champs de vision différents contenant trois à quatre cellules au point dans une liste de points.

Ensuite, capturez un instantané unique de chaque position dans la liste de points pour servir d’image de référence avant d’ajouter VHH-mCherry. Pour initier l’endocytose, ajoutez doucement 350 microlitres de solution VHH-mCherry préchauffée à chaque puits tout en minimisant les perturbations de la monocouche. Ensuite, procédez à l’acquisition d’images.

Effectuer une acquisition en accéléré pour 100 images à 32e intervalles tout en maintenant 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour analyser l’absorption endocytaire de VHH-mCherry, chargez les ensembles d’images en accéléré dans le logiciel d’analyse d’image. Appliquer des outils de segmentation et de suivi pour quantifier la fluorescence internalisée au fil du temps dans différentes régions d’intérêt.

Toutes les variantes de nanocorps fonctionnalisés ont été purifiées à haut rendement et pureté, seul le VHH-mCherry présentant une dégradation protéolytique mineure. Les produits de dégradation de VHH-mCherry ont été confirmés comme des domaines individuels de VHH-mCherry grâce à la détection d’immunoblots spécifiques à l’épitope. En l’absence de BirA, le VHH-mCherry a été récupéré à environ 20 milligrammes par préparation.

Et la biotinylation a été confirmée par un pulldown de streptavidine agarose sur des mélanges de nanocorps BSA. Les protéines de fusion marquées EGFP exprimées dans les cellules HeLa ont montré des schémas de localisation subcellulaires compatibles avec leurs homologues endogènes, y compris la localisation périnucléaire de l’EGFP-CDMPR et de l’EGFP-CIMPR. Localisation périnucléaire exclusive de l’EGFP-TGN46 et localisation périphérique du TfR-EGFP.

VHH-mCherry a permis la visualisation cellulaire vivante du transport endocytaire d’EGFP-CDMPR, montrant une colocalisation croissante sur 60 minutes. L’absorption de VHH-mCherry dans les cellules exprimant EGFP-CDMPR a atteint un plateau après environ 43 minutes, avec une demi-vie de neuf minutes. Dans les cellules exprimant TfR-EGFP, le VHH-mCherry s’est rapidement accumulé de façon intercellulaire avec une demi-vie de quatre minutes et une saturation après 20 minutes.

Nous avons mis en place une boîte à outils polyvalente basée sur les nanocorps pour analyser le transport de toute protéine transmembranaire depuis la surface cellulaire. Nous utilisons des nanocorps fluorescents pour marquer les protéines cargo de surface, puis nous étudions leur trafic endocytaire par microscopie à cellules vivantes. Avec notre approche d’imagerie cellulaire vivante basée sur les nanocorps, nous souhaitons découvrir des voies qui permettent de transporter des marchandises de la surface vers le réseau trans-Golgi.