Régulation médiée par miR-22 de la signalisation Wnt/β-caténine par la curcumine dans le rétinoblastome

Résumé

Cette étude présente un protocole d’évaluation des effets de la curcumine sur le comportement des cellules de rétinoblastome par la modulation de la voie Wnt/β-caténine et l’expression de miR-22.

Résumé

Le rétinoblastome (RB) est une tumeur maligne intraoculaire courante affectant les nourrissons et les enfants, mais son étiologie précise et sa pathogenèse restent incomplètement comprises. La curcumine, un polyphénol bioactif, inhibe la progression tumorale via la modulation médiée par les microARN de la cascade de signalisation Wnt/β-caténine. Cette étude visait à clarifier comment la curcumine médie ses effets antitumoraux dans RB en étudiant sa régulation de l’expression de miRNA-22 (miR-22) et en explorant les mécanismes moléculaires sous-jacents. Deux modèles validés de rétinoblastome (SO-RB50/WERI-Rb-1) ont été traités avec de la curcumine à des concentrations variables. Pour délimiter la régulation de la signalisation Wnt/β-caténine par miR-22, les cellules cibles ont été transduites soit avec un lentivirus mimique miR-22, soit avec un lentivirus témoin non fonctionnel. Des modèles tumoraux de xénogreffe ont été établis chez des souris en utilisant des cellules RB humaines pour observer les effets in vivo de la curcumine sur la taille de la tumeur, l’expression de miR-22 et les niveaux de protéine Wnt/β-caténine. La prolifération, l’invasion et l’apoptose cellulaires ont été évaluées à l’aide du test de coloration double CCK-8, Transwell et Annexin V-APC-PI, respectivement. Les niveaux de miR-22 ont été quantifiés par RT-PCR, et les profils d’expression de Wnt1 et de β-caténine ont été déterminés par analyse par transfert de Western. Le traitement à la curcumine a entraîné une diminution de la prolifération et de l’invasivité des cellules RB, tout en améliorant l’apoptose et en augmentant l’expression de miR-22. L’inhibition de miR-22 a diminué les effets de la curcumine sur la voie de signalisation Wnt/β-caténine. Dans les études de xénogreffe, la curcumine a considérablement réduit la taille de la tumeur et amélioré l’expression de miR-22 dans les tumeurs, supprimant efficacement la signalisation Wnt/β-caténine. Ces résultats démontrent que la curcumine inhibe la prolifération et l’invasivité des cellules RB tout en favorisant l’apoptose, principalement médiée par la régulation positive de miR-22 et l’inhibition ultérieure de la voie Wnt/β-caténine.

Introduction

Le rétinoblastome (RB), une tumeur maligne pédiatrique avec une forte agressivité apparaissant dans les tissus rétiniens, constitue une menace importante pour la santé, en particulier chez les enfants de moins de cinq ans. Les mutations génétiques, en particulier celles affectant le gène RB1, sont étroitement associées au développement de cette maladie¹. Compte tenu de la prévalence importante du rétinoblastome (RB) chez les nourrissons et les enfants, associée au fait qu’environ 9000 nouveaux cas sont signalés chaque année, principalement dans les pays à faible revenu et en développement, une compréhension com....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être des animaux (AEWC) de l’hôpital ophtalmologique de Tianjin (n° d’approbation. NKYY-DWLL-2023-054). Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Culture cellulaire

Des cellules des lignées de rétinoblastome humain WERI-Rb-1 et SO-RB50 ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié à haute teneur en glucose de Dulbecco, complété par 10 % de sérum fœtal de bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules ont été ensemencé....

Résultats

Effets anti-prolifératifs et anti-invasifs dose-dépendants de la curcumine sur les cellules de rétinoblastome humain, accompagnés de désactivation de la voie Wnt/β-caténine
Les cellules RB humaines ont été traitées avec des doses variables de curcumine sur une période de 24 heures. Les résultats ont révélé une baisse dose-dépendante de la viabilité et de l’invasion cellulaires, associée à une augmentation de l’apoptose. Plus précisément, à mesure que la concentration de curcumine augmentait de 10 à 50.......

Discussion

La curcumine, un polyphénol dérivé des rhizomes de Curcuma longa, est réputée pour ses propriétés anti-inflammatoires, antiangiogéniques, anti-prolifératives et antioxydantes ^23,24. De plus, il a des propriétés antitumorales, en particulier sa capacité à induire l’apoptose dans les cellules malignes²⁵. Bien que des recherches antérieures aient mis l’accent sur les effets suppresseurs de croissance de la cu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de coloration double Annexin V-APC/PI	Solarbio	Réf. CA1020	évaluer quantitativement l’apoptose dans les cellules RB par cytométrie en flux
Kit de dosage CCK-8	Beyotime	Réf. C0038	Mesurer l’absorbance à 490 nm pour évaluer la capacité de prolifération cellulaire
Incubateur CO2	Eppendorf		maintenir des conditions de culture optimales (37 ° ; C, 5 % de CO2 et humidité saturée) pour la propagation des cellules RB
Curcumine	Sigma	Réf. C1386	Étude des effets antitumoraux de la curcumine sur le rétinoblastome (RB)
Substrat chimiluminescent ECL	Bioss	Réf. C05-07004	; visualiser les bandes protéiques dans l’analyse par transfert Western
Sérum fœtal bovin (FBS)	VivaCell	C04001-500 C04002-500	Culture cellulaire
Cytométrie en flux	Beckman Coulter	Gallios	Analyser quantitativement le taux d’apoptose des cellules
Logiciel ImageJ	Instituts nationaux de la santé	Version 6	Analyse de la bande Western blot, évaluation des niveaux d’expression des protéines
Microscope inversé	Olympe	CKX53	observer et compter les cellules invasives à 400 fois ; grossissement dans le test Transwell
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Transfection cellulaire
Lecteur de microplaques  ;	Thermo	K3	dosage immuno-enzymatique (ELISA)
miR-22 mimime Lentivirus	Biotechnologie Hanheng	has-miR-22	établir une lignée cellulaire transfectée de manière stable pour l’expérimentation animale
Système PCR multiplex en temps réel	Bio-Rad	Le CFX384	effectuer une RT-PCR quantitative (qRT-PCR) pour une analyse précise de l’expression des gènes
Pénicilline-streptomycine (PS)	Abbkine	BMC1030	Ajouté aux milieux de culture cellulaire pour prévenir la contamination bactérienne
Kit d’extraction de protéines	Solarbio	BC3640-50T	isolement de protéines à partir d’échantillons cellulaires et tissulaires
Vecteur psiCHECK-2	Promega	JR20110328	construire des plasmides rapporteurs Wnt1-WT (de type sauvage) et Wnt1-MUT (mutant) pour étudier l’interaction entre miR-22 et Wnt1 3'UTR
Membrane PVDF	Merck	ISEQ00010	Transfert de protéines
Anticorps secondaires IgG de lapin	Technologies de signalisation cellulaire	14708	Détection par transfert Western par liaison à l’anticorps primaire
Logiciel statistique SPSS	IBM	SPSS 20.0	effectuer une analyse statistique des données expérimentales
SuperScript III Kit de synthèse premier brin SuperMix	Invitrogen	11752-050	; transcription inverse de l’ARN en ADNc pour l’analyse ultérieure par RT-PCR
SYBR Premix Ex Taq II Kit	Biographie de TaKaRa	RR820A	Pour que la RT-PCR détecte quantitativement l’expression de Wnt1, &beta ;-actine et d’autres gènes cibles
Réactif TRIzol	Invitrogen	12183-555	Extraction d’ARN à partir d’échantillons cellulaires et tissulaires
Spectrophotomètre UV	Beckman	DU800	déterminer la concentration et la pureté des échantillons d’ARN
Anticorps Wnt1	Abcam	AB15251	Analyse par transfert Western pour détecter l’expression de la protéine Wnt1
Anticorps anti-bêta-actine	Abcam	AB8227	utilisé comme référence interne pour normaliser la charge protéique dans l’analyse par transfert Western
Anticorps anti-bêta-caténine	Technologies de signalisation cellulaire	37447	Analyse par transfert Western pour détecter l’expression de la protéine &bêta-caténine