Name: Génie épigénétique des cellules K562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’ADN à l’aide des protéines de fusion dCas9-DNMT3A et -HDAC1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez l'édition épigénétique ciblée dans les cellules K562 grâce à un système CRISPR/dCas9 épisomal non intégratif combinant dCas9-DNMT3A et dCas9-HDAC1. Cette méthode permet une méthylation de l'ADN stable et précise avec des effets hors cible réduits.

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<li>Hofacker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+effector+domains+for+targeted+DNA+methylation+with+reduced+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects.</a> Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).</li>
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<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episomal+vectors+based+on+S%2FMAR+and+the+%CE%B2-globin+replicator%2C+encoding+a+synthetic+transcriptional+activator%2C+mediate+efficient+%CE%B3-globin+activation+in+haematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells.</a> Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).</li>
<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2-globin+replicator+greatly+enhances+the+potential+of+S%2FMAR+based+episomal+vectors+for+gene+transfer+into+human+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).</li>
<li>Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+cis-acting+sequences+improve+expression+and+establishment+of+a+nonviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).</li>
<li>Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+mitotic+stability+of+an+extra-chromosomal+mammalian+replicon%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon.</a> BMC Cell Biol. 8, 33(2007).</li>
<li>Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S%2FMAR-based+infectious+episomal+genomic+DNA+expression+vector+provides+long-term+regulated+functional+complementation+of+LDLR+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency.</a> Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Mix Master PCR numérique Absolute Q DNA (5x)</td><td>Biosystèmes appliqués</td><td>A52490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI-HF&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>ASCI</td><td>NEB</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>ASEI</td><td>NEB</td><td>R0526</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules mélodique BD FACS</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bglll</td><td>NEB</td><td>R0144</td><td></td></tr><tr><td>BspEI</td><td>NEB</td><td>R0540</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de solution désoxynucléotide (dNTP) (10 mM chacun)</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glucose élevé avec glutamine stable, avec milieu pyruvate de sodium</td><td>Biowest</td><td>L0103</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase I, gros fragment (Klenow)</td><td>NEB</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>DNMT3A (CD), séquences HDAC1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polymerase &nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0712</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td>Kit de conversion de bisulfite & nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit Epitect Bisulfite</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0734</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique sélectif à la génétiqueine (sulfate G418)</td><td>Gibco</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfection Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg ; &nbsp ; 5-alpha Competent&nbsp ;E. coli&nbsp ; (Haute efficacité)</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg ; &nbsp ; 5-alpha F’Iq&nbsp ; Competent&nbsp ;E. coli&nbsp ; (Haute efficacité)</td><td>NEB</td><td>C2992H</td><td></td></tr><tr><td>Tissu nucléospin &nbsp ;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td></td></tr><tr><td>PBS, solution 10x pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptycine 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>Vecteur pGuide</td><td>OriGene Technologies</td><td>GE100042</td><td></td></tr><tr><td>Phénol : Chloroforme : Alcool isoamylique 25:24:1 Saturé de 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Amorces, sgRNA & nbsp ;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conception du test PyroMark & nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>Version 2.0</td><td>Outil de conception d’amorce bisulfite &nbsp ;</td></tr><tr><td>Réactifs PyroMark Gold Q24</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR PyroMark &nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 MDx</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Station de travail de pyroséquençage &nbsp ;</td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Logiciels &nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>v2.0.8</td><td>Logiciel de pyroséquençage & nbsp ;</td></tr><tr><td>Q5 & reg ; ADN polymérase à haute fidélité</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inversée QuantiTect</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>Kit de plaques QuantStudio Absolute Q MAP16</td><td>Biosystèmes appliqués</td><td>A52865</td><td>Système PCR numérique &nbsp ;</td></tr><tr><td>Coloration en gel d’acides nucléiques verte I SYBR, concentration 10 000x en DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide kinase</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

génie épigénétique des cellules k562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’adn à l’aide des protéines de fusion dcas9-dnmt3a et -hdac1

Epigenetic Engineering of K562 Cells: Dual-Vector Episomal Strategy for Stable Targeted DNA Methylation using dCas9-DNMT3A and -HDAC1 Fusion Proteins

Génie épigénétique des cellules K562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’ADN à l’aide des protéines de fusion dCas9-DNMT3A et -HDAC1

Investigating the precise role of DNA methylation in gene transcriptional regulation and developing therapies targeting specific gene methylation patterns ...

epigenetic-engineering-k562-cells-dual-vector-episomal-strategy-for

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Nous décrivons ici un protocole pour générer des cellules souches pluripotentes induites humaines du sang périphérique en utilisant une stratégie de reprogrammation de episome base et les inhibiteurs d'histone déacétylase.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Des protocoles détaillés pour introduire une enzyme machiné split-TET2 (cidre) dans des cellules de mammifères pour hydroxymethylation chimique d’ADN inductible et remodelage épigénétique sont présentés.

Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Nous présentons ici un protocole pour la sélection in vitro de répresseurs transcriptionnels modifiés (ETR) avec une efficacité de silençage élevée, à long terme, stable et sur cible et une faible activité hors cible à l’échelle du génome. Ce flux de travail permet de réduire un répertoire initial et complexe de RTE candidats à une liste restreinte, adaptée à une évaluation plus approfondie dans des contextes thérapeutiquement pertinents.

In vitro Sélection de répresseurs transcriptionnels modifiés pour le silençage épigénétique ciblé

De nouvelles stratégies pour modéliser fidèlement les mutations somatiques dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) sont nécessaires pour mieux étudier la biologie des cellules souches hématopoïétiques et les hémopathies malignes. Ici, un protocole pour modéliser les mutations hétérozygotes de gain de fonction dans les HSPC en combinant l’utilisation de CRISPR / Cas9 et la double transduction du donneur rAAV est décrit.

Ingénierie des mutations hétérozygotes oncogéniques de gain de fonction dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines

Le protocole décrit les méthodes d’édition de l’épigénome basée sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) dans des lignées cellulaires humaines à l’aide de la transfection de l’ADN plasmidique et de la nucléofection de l’ARNm.

Édition de l’épigénome CRISPR dans des cellules humaines à l’aide de la transfection de l’ADN plasmidique et de la nucléofection de l’ARNm

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Découvrez l'édition épigénétique ciblée dans les cellules K562 grâce à un système CRISPR/dCas9 épisomal non intégratif combinant dCas9-DNMT3A et dCas9-HDAC1. Cette méthode permet une méthylation de l'ADN stable et précise avec des effets hors cible réduits.

Génie épigénétique des cellules K562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’ADN à l’aide des protéines de fusion dCas9-DNMT3A et -HDAC1 (Vidéo) | JoVE Journal

Génie épigénétique des cellules K562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’ADN à l’aide des protéines de fusion dCas9-DNMT3A et -HDAC1

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