Génie épigénétique des cellules K562 : stratégie épisomale à double vecteur pour la méthylation ciblée stable de l’ADN à l’aide des protéines de fusion dCas9-DNMT3A et -HDAC1

Nos recherches visent à développer un système stable et non intégré pour la méthylation ciblée de l’ADN, en explorant l’édition épigénétique durable dans les cellules K562. Les avancées récentes dans le domaine incluent les systèmes CRISPR-dCas9 à double effecteur, combinant des enzymes épigénétiques pour une modification épigénétique synergique, stable et locale spécifique. Pour commencer, maintenez les cellules K562 dans des fioles de culture T75 à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et des conditions humidifiées.

Quantifier l’ADN épisomal à utiliser pour la transfection à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nanomètres. Utilisez huit microgrammes d’ADN plasmidique total par transfection en préparant quatre microgrammes de chaque plasmide pour une co-transfection, puis mélangez la quantité requise avec 90 microlitres d’eau ultrapure. Ajoutez maintenant 10 microlitres de solution d’acétate de sodium à 3 molaires et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % à la solution d’ADN diluée.

Mélangez soigneusement la solution d’ADN et incubez-la toute la nuit à 20 degrés Celsius pour permettre la précipitation de l’ADN. Le lendemain, centrifugez le tube de précipitation de l’ADN à 11 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité, jetez soigneusement le surnageant du tube.

Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 70 % dans le tube pour laver le pellet, puis centrifugez à nouveau à 11 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez complètement le surnageant éthanol du tube et laissez sécher la pelote d’ADN à l’air libre jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’éthanol visible. Ensuite, resuspendez soigneusement la granule d’ADN séchée dans 50 microlitres de DMEM.

Conservez environ 400 nanogrammes d’ADN en suspension à environ 2,5 microlitres dans un nouveau tube, et stockez la solution plasmidique DMEM à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Analysez l’échantillon d’ADN restant sur un gel à 1 % de agarose pour vérifier la purification et l’intégrité de l’ADN. Prélever les cellules de K562 dans une fiole T75 lorsque les cultures atteignent une confluence de 50 à 60 % afin d’assurer une efficacité optimale de transfection.

Comptez les cellules prélevées à l’aide d’un hémocytomètre, puis transférez un volume contenant deux fois 10 à la puissance de cinq cellules dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant 900 microlitres de DMEM sans FBS ni antibiotiques. Placez la cuve de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pour maintenir les cellules prêtes à la transfection. Utilisez un kit de transfection à base de lipofectamine pour délivrer les plasmides en suivant les instructions du fabricant et en ajustant les volumes si nécessaire.

Ajoutez trois microlitres de réactif P3000 à la solution plasmidique DMEM préparée précédemment. Mélangez doucement et faites couver le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez maintenant cinq microlitres de réactif Lipofectamine 3000 avec suffisamment de DMEM pour atteindre un volume final de 100 microlitres.

Faites écouver ce mélange de transfection à température ambiante pendant 15 minutes. Ajoutez les 100 microlitres complets du mélange de transfection dans le plat de culture de 35 millimètres contenant les cellules. Secouez doucement le plat pour répartir le mélange uniformément, puis remettez-le dans l’incubateur.

24 heures après la transfection, ajoutez trois millilitres de DMEM complet complétés avec 10 % de FBS et une fois de la streptomycine à la pénicilline pour favoriser la prolifération des cellules transfectées. À 72 heures après la transfection, commencez la sélection en ajoutant l’antibiotique G418 pour atteindre une concentration finale d’un milligramme par millilitre. Une fois le processus de sélection établi et le nombre total de cellules dépassé un fois 10 pour la puissance de six, prélever les cellules par centrifugation à 300 G pendant six minutes à 25 degrés Celsius.

Lavez le pellet une fois avec un PBS stérile unique, pH environ 7,4, puis centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions. Après avoir resuspendu la dernière pellete cellulaire dans un PBS à une fois, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Diluez la suspension à un fois 10 à la puissance de six cellules par millilitre, en veillant à ce que les cellules soient complètement resuspendues, puis transférez les cellules dans un tube de cytométrie en flux.

Ensuite, configurez le trieur cellulaire activé par fluorescence en mode cellule unique en utilisant une plaque traitée en culture tissulaire de 96 puits comme dispositif de collecte. Ajustez les paramètres logiciels selon l’instrument utilisé. Verrouillez la population primaire en sélectionnant les cellules en fonction de la diffusion directe et latérale afin d’isoler la taille et la granularité attendues.

Excluez les débris et les cellules très granulaires ou mortes, et utilisez la zone de dispersion avant versus hauteur ou la zone de dispersion latérale versus les graphiques de hauteur pour les singlets de porte. Ensuite, pré-remplir chaque puits de la plaque à 96 puits avec 100 microlitres de milieu complet contenant un milligramme par millilitre de G418, et chauffer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Effectuer le tri de cellules en mode cellule unique, en maintenant le taux de tri en dessous de 300 événements par seconde pour améliorer la précision.

Après le tri, inspectez chaque puits au microscope pour confirmer la présence d’une seule cellule par puits, et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius contenant 5 % de dioxyde de carbone. Laissez les clones unicellulaires s’étendre individuellement dans la plaque à 96 puits. Une fois la croissance clonale visible, ajouter un milieu contenant du G418 réduit aux puits jusqu’à une concentration finale de 400 microgrammes par millilitre pour maintenir la pression de sélection.

Transférer les clones en croissance bien développée séquentiellement vers des plaques à 12 puits, puis vers des flasques T25, et enfin vers des flasques T75 selon les besoins, jusqu’à ce que chaque clone atteigne environ un fois 10 à la puissance de six cellules. Ensuite, collectez des granulés à double cellule à intervalles réguliers. Conservez un pellet à moins 20 degrés Celsius pour l’extraction d’ADN génomique.

Homogénéisez un second pellet dans 500 microlitres de réactif TRIzol, et stockez-le à moins 20 degrés Celsius pour l’extraction d’ARN et la synthèse complémentaire de l’ADN. Extraire l’ADN génomique de clones sélectionnés à l’aide d’extraction de phénol-chloroforme suivie de précipitations d’éthanol. Resuspendez complètement l’ADN extrait dans de l’eau sans nucléase ou dans un tampon TE.

Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre avant de continuer les étapes en aval. Enfin, extraire l’ARN total des granulés cellulaires stockés à l’aide d’un réactif TRIzol, suivi d’une précipitation d’isopropanol. Les cellules uniques ont été triées en plaques de 96 puits en utilisant un tri cellulaire activé par fluorescence pour isoler celles portant les deux constructions.

L’analyse PCR de 10 clones étendus a confirmé que seuls certains conservaient les deux constructions, indiqués par des bandes à 230 paires de bases et 205 paires de bases. Le pyrosséquençage a révélé que le clone deux positif présentait une méthylation accrue à plusieurs sites CPG près de la région cible de gRNA1 par rapport au témoin non transfecté. Nous abordons le manque de systèmes de délivrance à long terme non intégrés, permettant une édition épigénétique précise et stable sans modifier le génome de l’hôte.

Nos résultats établissent un outil fiable pour étudier la régulation des gènes via la méthylation de la cible, et soutiennent le développement de thérapies épigénétiques précises possibles. Les recherches futures exploreront l’amélioration de la délivrance épisomale, la minimisation des effets cibles, l’amélioration de l’efficacité du Cas9, et l’adaptation du système aux modèles primaires ou in vivo.