Name: Localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Découvrez la localisation des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine dans les cellules N2a de mammifères par imagerie confocale à pH sensible. Cette méthode quantifie précisément l'expression membranaire et intracellulaire pour l'étude du trafic récepteur.

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<table><tbody><tr><td>0,25 % de Trypsine-EDTA (1X)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Réactif de détachement cellulaire</td></tr><tr><td>Alpha-Bungarotoxine Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>B35450</td><td>Conjugué alpha-bungarotoxine</td></tr><tr><td>Cabinet de biosécurité BSL-niveau 1 & nbsp ;</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Zone de travail en culture cellulaire stérile</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9224</td><td>Composant tampon</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>MilliPore Sigma&nbsp ;</td><td>G8270</td><td>Composant tampon</td></tr><tr><td>EMEM avec L-glutamine</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Milieu cellulaire</td></tr><tr><td>ADN sans endotoxines</td><td>Fabriqué maison avec des kits Zymo</td><td>non applicable</td><td>ADN nAChR destinés à être utilisés pour les transfections transitoires cellulaires</td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges sans endotoxines, 0,5 mL&nbsp ;</td><td>Aventor/VWR</td><td>89000-010</td><td>ADN et préparation de la transfection</td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges sans endotoxines, 1,5 mL&nbsp ;</td><td>Aventor/VWR</td><td>20170-038</td><td>ADN et préparation de la transfection</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Aventor/VWR</td><td>97068-085</td><td>Supplément sérique</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i</td><td>Olympe</td><td>FV10i</td><td>Confocal Microscope</td></tr><tr><td>Plats MatTek à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>Antennes d’imagerie</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v. 10</td><td>GraphPad Prism</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>Logiciels d’analyse de données</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp ;</td><td>H3375</td><td>Composant tampon</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Thermosciences</td><td>413410025</td><td>Composant tampon</td></tr><tr><td>Hydrate MES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp ;</td><td>M5287</td><td>Composant tampon</td></tr><tr><td>mTagBFP2-pBAD</td><td>AddGene&nbsp ;</td><td>54572</td><td>ADN témoin destiné à la transfection de transitoires cellulaires &nbsp ;</td></tr><tr><td>Cellules Neuro 2 A (N2a)</td><td>Collection de la culture de type américain</td><td>CCL-131</td><td>Cellules utilisées pour les transfections d’ADN et l’expression de nAChR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Milieu sérique réduit</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Aventor/VWR</td><td>K952-100mL</td><td>Antibiotique</td></tr><tr><td>Pompe à péristalsis</td><td>Gilson</td><td>MiniPuls3</td><td>Le tampon change lors de l’imagerie &nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée phosphate</td><td>Qualité biologique</td><td>119-069-131</td><td>Tampon de sérum physiologique</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond & nbsp ;</td><td>140084</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pointes de pipet (stériles et sans endotoxines, 1000 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389216</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pointes de pipet (stériles et sans endotoxines, 20 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389229</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pointes de pipet (stériles et sans endotoxines, 250 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389246</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pipettes, P10</td><td>Rainin & nbsp ;</td><td>L-10XLS</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pipettes, P100</td><td>Rainin & nbsp ;</td><td>L-100XLS</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pipettes, P1000</td><td>Rainin & nbsp ;</td><td>L-1000XLS</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>MilliPore Sigma&nbsp ;</td><td>P3911</td><td>Composant tampon</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 10 ML)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-898</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 25 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-900</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 5 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>76201-710</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (stériles et sans endotoxines, 50 mL)</td><td>Aventor/VWR</td><td>75816-088</td><td>Transfert précis de liquide</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9286</td><td>Composant tampon</td></tr><tr><td>Flasque de culture tissulaire</td><td>Faucon</td><td>353109</td><td>Culture des plats</td></tr><tr><td>Kit Maxiprep plasmide ZymoPure II</td><td>RECHERCHE SUR ZYMO</td><td>D4203-A + D4203-B</td><td>Production d’ADN sans endotoxines</td></tr><tr><td>&alpha ; 4-SEP&nbsp ;</td><td>Services de synthèse génétique ThermoFisher Scientific GeneArt & nbsp ; &nbsp ;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Services personnalisés de synthèse génique</td></tr><tr><td>&alpha ; 7-pHuji</td><td>Twist Bioscience</td><td>https://www.twistbioscience.com/</td><td>Services personnalisés de synthèse génique</td></tr><tr><td>&bêta ; 2-pHuji</td><td>Services de synthèse génétique ThermoFisher Scientific GeneArt & nbsp ; &nbsp ;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Services personnalisés de synthèse génique</td></tr></tbody></table>

localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères

Localization of Plasma Membrane and Intracellular Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Quantitative Imaging in Mammalian Cells

Localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères

Quantification of neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) expressed on the plasma membrane of mammalian cells is important for the development ...

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JoVE Journal

Biochemistry

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Nous avons développé une nouvelle technique de quantification des changements récepteurs de l'acétylcholine nicotiniques au sein des régions subcellulaires de sous-types spécifiques de neurones du SNC afin de mieux comprendre les mécanismes de dépendance à la nicotine en utilisant une combinaison d'approches, y compris le marquage fluorescent protein du récepteur à l'aide du knock-in approche et spectrale imagerie confocale.

Spectral imagerie confocale de fluorescence tels taggés récepteurs nicotiniques dans souris knock-in avec l&#39;administration chronique de nicotine

En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d'insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l'insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

Source : Zhang, J., et al. Analyse quantitative immunogold à haute résolution des récepteurs membranaires au niveau des synapses du ruban rétinien. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une technique de microscopie électronique pour visualiser la localisation des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses rétiniennes. Les coupes rétiniennes contiennent des cellules ganglionnaires rétiniennes qui présentent des récepteurs de neurotransmetteurs liés à la membrane et sont marquées avec...

Imagerie à haute résolution des récepteurs de neurotransmetteurs au niveau des synapses rétiniennes

Dans cet article, nous décrivons une méthode utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les neurones du cerveau tranches isolés de manière aiguë. Ce procédé implique l'utilisation d'une micropipette remplie de médicament pour application locale de médicaments à des neurones enregistrés à l'aide des techniques classiques de patch-clamp.

Application locale de médicaments pour l&#39;étude des fonctions récepteur de l&#39;acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

Nous avons développé une préparation génique-chimérique du circuit hippocampique ventral – accumbens in vitro qui permet l’imagerie directe en direct pour analyser les mécanismes présynaptiques de la transmission synaptique médiée par les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChR). Cette préparation fournit également une approche informative pour étudier les mécanismes pré- et post-synaptiques de la plasticité synaptique.

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

La méthode de post-intégration immunogold est l’un des moyens les plus efficaces de fournir des analyses à haute résolution de la localisation subcellulaire de molécules spécifiques. Nous décrivons ici un protocole permettant d’analyser quantitativement les récepteurs du glutamate au niveau des synapses du ruban rétinien.

Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Cet article présente une méthode pour l’étude des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (Nachr) dans des coupes de cerveau de souris par la nicotine uncaging. Lorsqu’il est couplé avec enregistrement de simultanée patch clamp et 2 photons laser, microscopie à balayage, la nicotine uncaging relie fonction des récepteurs nicotiniques avec une morphologie cellulaire, offrant une meilleure compréhension de la neurobiologie cholinergique.

Sonder la fonction des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine dans les coupes de cerveau de souris par photolyse éclair au Laser de la Nicotine Photoactivatable

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Découvrez la localisation des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine dans les cellules N2a de mammifères par imagerie confocale à pH sensible. Cette méthode quantifie précisément l'expression membranaire et intracellulaire pour l'étude du trafic récepteur.

Localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal

Localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères

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