Localisation des récepteurs de la membrane plasmique et des récepteurs de l’acétylcholine nicotinique neuronale intracellulaire à l’aide de l’imagerie quantitative dans les cellules de mammifères

Comprendre le trafic des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine vers les membranes plasmatiques des mammifères est crucial pour étudier la régulation médiée par la chaperonne et évaluer les thérapies sélectives par cible. Un avantage principal des sondes sensibles au pH combinées à la microscopie confocale à cellules vivantes est la haute résolution spatiale de la localisation des sous-unités. Pour commencer, préchauffez les réactifs à 37 degrés Celsius.

Décongelez complètement la sous-unité nAChR DNase et amenez le réactif de transfection à température ambiante. Nettoyez tous les réactifs avec 70 % d’éthanol avant de les placer dans l’armoire de biosécurité. Pour exprimer les nAChR alpha-7, dans un tube microcentrifuge, diluez la DNase plasmidique alpha-7 et NACHO dans un milieu sérique réduit.

Mélangez doucement en pipettant après l’ajout d’ADN. Sinon, pour exprimer les récepteurs alpha-4 bêta-2, diluez 4 microgrammes de chaque ADN sous-unit en un total de 250 microlitres de milieu sérique réduit et mélangez doucement. Ajustez les rapports de sous-unités pour optimiser l’expression des isoformes spécifiques des récepteurs.

Pour les récepteurs alpha-4 bêta-2 avec un plasmide supplémentaire, ajoutez des quantités égales de chaque ADN plasmidique. Ensuite, dans un nouveau tube de microcentrifugeuse, diluez 8 microlitres de réactif de transfection goutte par goutte dans 250 microlitres de milieu sérique réduit. Après une incubation de 5 minutes à température ambiante, mélangez la DNase diluée avec le réactif de transfection dilué goutte à goutte dans un tube.

Mélangez doucement en pipettant et faites couver pendant 20 minutes à température ambiante. Pendant que les complexes se forment, remplacez le milieu dans les vaisselles de culture par 1 millilitre d’EMEM sans sérum. Ajoutez 500 microlitres du complexe de réactif de transfection d’ADN goutte à goutte dans chaque plat.

Mélangez doucement en balançant la plaque pour répartir uniformément, surtout sur la surface du fond du verre. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures puis remettez le milieu après 4 à 6 heures. Retirez l’ancien substrat par aspiration.

Rincez le plat trois fois avec deux millilitres de PBS pendant 10 minutes chacun à température ambiante. Ajoutez ensuite 2 millilitres de tampon d’imagerie pH 7,4 à la parabole. Insérez la plaque d’imagerie dans le porte-lames d’un microscope confocal et placez le support dans la chambre environnementale préchauffée.

Reliez le tube de la pompe péristaltique au porte-vaisselle d’imagerie et fermez la chambre environnementale. Maintenant, lance le logiciel d’imagerie et sélectionne les lasers pour les fluorophores d’intérêt. Scannez l’antenne pour localiser les cellules à l’imagerie avec un objectif 10-60 x.

Augmentez le grossissement si désiré, et ajustez la profondeur de mise au point si nécessaire. Sélectionnez la résolution préférée et capturez une seule image en utilisant l’objectif souhaité. Enregistrez l’emplacement sur la carte parabol pour relocaliser les mêmes cellules après le changement de tampon.

Répétez l’imagerie pour plusieurs zones de l’antenne en utilisant les mêmes réglages de capture pour toutes les images. En ne reliant que la conduite de sortie à la pompe péristaltique, aspirez lentement le tampon pH 7,4 de la parabole vers un conteneur à déchets. Ensuite, transférez la ligne d’entrée vers le tampon de trempe pH 5,5.

Allumez la pompe péristaltique pour ajouter un tampon de pH 5,5 à un débit de 1,5 millilitre par minute, afin de garantir que les cellules restent attachées. Après 20 minutes, éteignez la pompe et incubez les cellules du tampon pendant 20 minutes supplémentaires pour permettre l’équilibre. Après l’incubation, répétez l’imagerie des sites enregistrés.

Pour commencer la quantification de l’image, ouvrez ImageJ et chargez l’image à analyser. L’image apparaîtra sous forme de pile avec chaque canal capturé affiché dans la même image. Naviguez vers le canal de phase.

Si l’image semble trop lumineuse, sélectionnez Traiter et choisissez Améliorer le contraste puis cliquez sur OK. Utilisez l’outil de loupe pour zoomer sur une cellule. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour tracer le contour de la cellule dans le canal de phase. Ensuite, basculez sur le canal fluorescent correspondant au fluorophore d’intérêt.

Définissez les mesures souhaitées en sélectionnant Analyser et en cliquant sur Mesures en série. Assurez-vous que la surface, la valeur grise moyenne et la densité intégrée sont vérifiées. Pour mesurer la région sélectionnée, choisissez Analyser puis cliquez sur Mesurer.

Effectuez trois mesures de fond en traçant les zones vides près de la cellule sélectionnée. Après avoir effectué les mesures de toutes les cellules souhaitées, copiez-collez les données de mesure dans Excel pour analyse. Ensuite, calculez la moyenne de fond à partir des trois mesures de fond.

Calculez la fluorescence totale corrigée de la cellule ou la valeur CTCF pour chaque cellule en utilisant la formule fournie. En utilisant le même flux de travail, analysez les images acquises après le changement de tampon. Exportez tous les résultats vers un logiciel d’analyse de données pour le traitement statistique.

Une faible coloration alpha-BTX AF647 a été observée dans des cellules N2a non transfectées tandis qu’un marquage robuste des ponctés a été détecté dans des cellules transfectées avec de l’ADN alpha-7. La quantification a confirmé que l’expression des nAChR alpha-7 par la membrane plasmique était significativement plus élevée dans les cellules N2a transfectées alpha-7 que dans les témoins non transfectés. À un pH de 7,4, la fluorescence totale alpha-7 pHuji était visible à la membrane plasmique.

dans les cellules N2a transfectées. À pH 5,5, la fluorescence alpha-7 pHuji a été réduite, révélant la localisation interne des récepteurs. La fluorescence externe du récepteur alpha-7 pHuji a expliqué la majorité de l’expression des récepteurs.

La quantification a montré que 82,6 % des récepteurs alpha-7 pHuji étaient situés sur la membrane plasmique, tandis que 17,4 % étaient internes. La fluorescence a été rétablie lors du retour à un pH de 7,4, confirmant la réversibilité du signal pHuji. À pH 7,4, les cellules N2a exprimant alpha-4 SEP et bêta-2 pHuji ont montré une fluorescence membranaire robuste pour les deux sous-unités.

Au pH 5,5, la fluorescence a été atténuée, indiquant la localisation interne de certaines sous-unités alpha-4 SEP et bêta-2 pHuji. La quantification a montré que 76,5 % de la SEP alpha-4 se trouvait à la membrane plasmique, et 23,4 % à l’interne. Dans les cellules triple transfectées, l’alpha-4 SEP présentait une localisation membranaire de 82,8 % et une expression interne de 17,2 %.

Dans les mêmes cellules, 63,4 % des sous-unités bêta-2 pHuji étaient localisées sur la membrane tandis que 36,6 % étaient situées intracellulairement. En utilisant le protocole présenté, nous avons caractérisé de nouveaux effets de chaperonne sur l’expression et le trafic des récepteurs nicotiniques, et évalué de nouvelles thérapies sélectives par cible. Un avantage de notre protocole est l’adaptabilité pour les récepteurs nicotiniques homomériques et hétéromères, permettant de quantifier la localisation cellulaire relative.

Notre approche permet une expression rapide et robuste des membranes plasmatiques des récepteurs nicotiniques, facilitant l’analyse du trafic médié par la chaperonne et les efforts de découverte de médicaments.