Génération d’un modèle à base d’organoïdes prostatiques de souris pour étudier les interactions hôte-pathogène

Cette recherche vise à comprendre comment les bactéries pathogènes infectent l’épithélium de la prostate, et quelles interactions hôte-pathogène déterminent l’issue de l’infection. Les modèles in vitro existants capturaient mal la diversité épithéliale prostatique. Ce modèle fournit un système physiologiquement pertinent qui reflète les différents types cellulaires présents dans le tissu.

Pour commencer, obtenir des organoïdes prostatiques murins tridimensionnels cultivés sur des gouttes de matrice extracellulaire dans une plaque à 24 puits. Aspirez le milieu à partir du nombre désiré de puits et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture frais à chaque puits. À l’aide d’une pipette P 1000, on perturbe mécaniquement la chute de la matrice extracellulaire dans chaque puits.

Collectez cette suspension dans un tube conique de 15 millilitres avec au maximum deux puits collectés par tube. Ajoutez un substrat de culture frais pour porter le volume à 10 millilitres. Inversez doucement le tube trois à quatre fois pour mélanger et centrifugez à 450 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez le surnageant. Résuspendez la pellete dans deux millilitres de solution enzymatique, préchauffez à 37 degrés Celsius et incubez la suspension dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette P 1000, mélangez la suspension cellulaire toutes les cinq minutes pendant l’incubation.

Après l’incubation, ajoutez un milieu de culture frais pour atteindre un volume final de 10 millilitres. Inversez doucement le tube trois à quatre fois pour mélanger. Centrifugez à 450 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirez le surnageant sans déranger la pastille. Resuspendez le pellet dans 300 microlitres de milieu de culture complété par un inhibiteur de roche de 10 micromolaires. À l’aide d’une chambre de comptage de neubauer, comptez les cellules en suspension.

Diluer la suspension à une concentration de 62 500 cellules par millilitre dans un milieu de culture complété par un inhibiteur de roche de 10 micromolaires. Ensuite, ensemence 200 microlitres de suspension par puits pour une plaque de 48 puits et 300 microlitres par puits pour les microlames chambrées. Incubez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après une journée, vérifiez si la plupart des cellules individuelles se sont attachées à la surface de culture bidimensionnelle. Remplacez le milieu culturel tous les deux à trois jours et poursuivez la culture jusqu’à ce que la confluence soit atteinte dans les sept jours. Pour induire la différenciation afin d’enrichir les cellules luminales, ajoutez 10 nanomolaires de cinq alpha dihydrotestostérone ou DHT à la suspension cellulaire lors de l’ensemencement.

Tracez la souche uropathogène d’Escherichia coli, ou UPEC, sur une plaque agar LB complétée par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. En utilisant une anille stérile, inoculez trois millilitres de bouillon LB complétés par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline avec une seule colonie bactérienne.

Incubez la culture statiquement à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Vortex la culture bactérienne pendant la nuit. Mesurez la densité optique de la culture à 600 nanomètres.

Ensuite, calculez le volume de culture nécessaire pour atteindre une densité optique de départ de 0,05 dans trois millilitres de bouillon. Ajoutez le volume calculé de culture bactérienne au bouillon de LB frais complété en ampicilline. Incubez statiquement à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Après l’incubation, la culture bactérienne est transformée en vortex. Mesurez la densité optique à 600 nanomètres. Calculez le volume de culture nécessaire pour atteindre une densité optique de un.

Centrifugez le volume requis à 12 000 G pendant deux minutes à température ambiante. Aspirez et jetez le surnageant. Resuspendez la pellete bactérienne dans un millilitre de primus et un milieu de culture organoïde libre sans DHT.

Ensuite, diluer la suspension avec un milieu organoïde prostatique de souris pour obtenir une multiplicité d’infection de 100. Aspirez le milieu de culture à partir du modèle organoïde préparé. Ajoutez 200 microlitres de milieu de culture contenant des bactéries dans chaque puits d’une plaque à 48 puits.

Incubez pendant une heure dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Aspirez les bactéries contenant un milieu provenant des puits et lavez les puits trois fois avec un substrat de culture frais pour éliminer les bactéries extracellulaires. Ensuite, ajoutez un milieu de culture contenant 50 microgrammes par millilitre de gentamycine et faites couver pendant 30 minutes.

Aspirez le substrat. Ajoutez un milieu de culture frais, complété avec 10 microgrammes par millilitre de gentamycine pour le reste de l’infection. Utilisez un microscope confocal pour imager les cellules infectées après coloration fluorescente et quantifier les cellules infectées à l’aide d’un cytomètre en flux.

Dans la condition témoin sans dihydrotestostérone, la plupart des cellules étaient cytokératine, cinq cellules basales positives, avec seulement quelques-unes présentant une faible expression luminale CD24 8. En complétant avec une nanomolaire DHT, on a produit des populations luminales basales mixtes, bien que le CD 24A soit resté bas. Augmenter la DHT à 10 nanomolaires favorisait la différenciation en cellules luminales, tout en maintenant certains cellules basales après sept jours de culture.

Cela est corrélé avec les études de quantification montrant une diminution de la cytokératine à cinq cellules basales positives et une augmentation des cellules luminales positives à CD 24A, avec une concentration de DHT croissante au fil du temps. À zéro heure après l’infection, l’UPEC a adhéré en grand nombre aux cellules épithéliales. Après un traitement à la gentamycine d’une heure, le nombre de cellules UPEC positives a fortement diminué.

À 24 heures, le nombre de cellules infectées était similaire à celui d’une heure. L’imagerie confocale à 24 heures a montré que les bactéries intracellulaires continuaient de se répliquer, formant des groupes de type communauté. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier la dynamique des infections bactériennes et ces interactions entre agents pathogènes dans un modèle qui préserve la diversité cellulaire épithéliale.

De futures études pourront utiliser ce modèle pour étudier diverses maladies de la prostate, y compris les infections, la biologie du cancer, et tester des composés thérapeutiques potentiels.