Un pipeline informatique pour la quantification de l’ARN amplificateur intergénique/intragénique dans les cellules souches embryonnaires de souris

Notre groupe étudie l’épigénétique et l’épitranscriptomique des améliorateurs, en se concentrant sur le développement de méthodes précises pour quantifier les ARN des amplificateurs comme indicateurs de leur activation. Parce que les amplificateurs intragéniques étaient avec les transcripts hôtes, distinguer les signaux DER des amplificateurs et les quantifier précisément est difficile. Pour commencer, ouvrir le terminal et taper la commande pour préparer les fichiers et références nécessaires à l’identification de l’enhancer.

Tapez la commande dans le terminal pour entrer dans le répertoire de travail. Ensuite, exécutez la commande qui copie les scripts d’identification des améliorateurs dans le répertoire courant. Ensuite, exécutez la commande correspondante pour générer des fichiers BED pour les régions promotrices, les corps géniques et les gènes codant les protéines en utilisant l’annotation du code générique.

Préparer les fichiers ATAC-seq et histone ChIP-seq pour l’identification des améliorateurs. Entrez la commande de prétraitement appropriée dans le terminal. Ensuite, exécutez la commande pour définir et classer les amplificateurs en utilisant les données de pic de chromatine.

Tapez la commande pour assigner des informations temporaires sur le brin au fichier BED de l’amplificateur intergénique. Ensuite, entrez la commande pour déterminer la direction correcte des brins pour les amplificateurs intergéniques qui chevauchent les gènes présents sur les deux brins. Ensuite, calculez les RPKM spécifiques aux brins pour les gènes qui chevauchent les amplificateurs sur le même brin.

Puis entre la commande pour finaliser l’attribution des brins pour les amplificateurs intergéniques. Attribuer les informations finales sur les brins à tous les amplificateurs intergéniques et à leurs régions sommitaires correspondantes. Tapez la commande dans le terminal pour la déplacer vers le répertoire racine du pipeline.

Ensuite, utilisez la commande appropriée pour copier le script de préparation de l’analyse en aval. En utilisant la commande appropriée, préparez tous les fichiers nécessaires pour l’agrégation des enhancers, le traitement du signal GRO-seq et la quantification de l’ARN des enhancers. Ensuite, tapez le script pour entrer dans le répertoire de travail, puis copiez les scripts nécessaires pour l’analyse en aval. Créer des graphiques d’agrégation, montrant les motifs de signaux de chromatine autour de chaque type de sommet d’amplification.

Tapez la commande correspondante dans le terminal. Une fois que l’invite revient, entrez la commande pour quantifier les niveaux d’expression de l’ARN amplificateur à partir de GRO-seq en utilisant le nombre de caractéristiques. Enfin, exécutez le script pour visualiser et comparer les niveaux d’expression de l’ARN d’enhancer entre groupes d’enhancers en utilisant R.In l’ensemble de données GRO-seq.

Des queues de polynucléotides étaient présentes avant le trim et retirées avec succès après l’application des ensembles de données ATAC-seq de fin altérées par paramètres de triage. Les séquences adaptateurs NextEra ont été détectées dans les deux paires rouges avant le triming et ont été retirées après le prétraitement des ensembles de données ChIP-seq pour l’acétylation H3K27 qui ont montré une contamination minimale de l’adaptateur, ne nécessitant que le découpage par défaut. Le filtrage des données ATAC-seq a révélé 71 165 régions de chromatine ouverte non motrices, dont 47 317 régions d’amplificateurs, dont 23 147 étaient classées comme actives et 24 170 comme non actives sur la base de chevauchements avec les marques d’histones ; parmi toutes les régions d’amplificateurs, 45,2 % étaient intergéniques et 54,8 % intragéniques. Cette répartition était similaire entre les catégories d’amplificateurs non actifs et actifs.

Un amplificateur intergénique en amont du gène NENO a montré un fort enrichissement pour les signaux ATAC-seq, la monométhylation H3K4, l’acétylation H3K27 et les signaux GRO-seq. Un amplificateur intragénique proche du gène CHD2 présentait des caractéristiques de chromatine et de transcription similaires à celles du NENOG avec des signaux clairs dans les quatre ensembles de données. Les graphiques d’agrégation ont montré que les amplificateurs actifs avaient un enrichissement coordonné des signaux d’acétylation ATAC-seq, H3K4 monométhyle et H3K27.

Les amplificateurs non actifs manquaient d’enrichissement d’acétylation H3K27, mais conservaient de forts signaux ATAC-seq et H3K4 monométhylique. Les amplificateurs actifs ont montré une transcription dérivée de GRO-seq significativement plus élevée que les amplificateurs non actifs dans les régions intergéniques et intragéniques. Nous assemblons ces pipelines de calcul d’ARNe, conscients des tendances, validés par transcription dépendante de l’activité dans un contexte intergénique ou intragénique.

Nous abordons la RED d’une quantification standardisée et accessible des ARNe, en particulier pour les amplificateurs intragéniques confondus par le génome de l’hôte. Nous réviserons l’identification auto-guidée en séparant les transcripts opératoires à la fois des tendances et du pipeline d’analyse des benchmarks à travers les assemblages génomiques, les protocoles expérimentaux et les types cellulaires.