Une technique simple de microaspiration pour isoler les cellules somatiques du sperme équin cryopréservé en tant que donneurs nucléaires pour le clonage

Nous visons à montrer que les cellules somatiques issues du sperme équin cryopréservé peuvent être utiles pour récupérer des individus ayant une forte valeur génétique. Notre défi actuel est de pouvoir sélectionner des cellules somatiques avec de l’ADN diploïde intact à utiliser comme donneur nucléaire. Pour commencer, retirez les pailles de sperme équin de la cuve d’azote liquide.

Exposez-les à l’air pendant 10 secondes, puis décongelez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes. Prélève un échantillon de 250 microlitres du sperme décongelé. Diluez-le avec un millilitre de medium DMEM-F12 complété.

Incubez le mélange de sperme à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pipettez 25 microlitres de la dilution incubée dans un tube, puis diluez-les dans 975 microlitres de DPBS complétés avec 0,1 milligramme par millilitre d’alcool polyvinylique ou de polyvinyl pyrrolidone. Mélangez doucement la suspension.

Maintenez le mélange de sperme dilué à 37 degrés Celsius pendant tout le processus de collecte cellulaire. Placez un couvercle en boîte de Petri contenant du sperme équestre dilué sur la scène du microscope pour préparer la collecte des cellules somatiques. Sélectionnez une micropipette de diamètre approprié pour la collecte des cellules somatiques et connectez-la au système d’aspiration mécanique.

Insérez soigneusement la micropipette dans la micro-goutte et alignez-la avec la base du couvercle de la vaisselle. Une fois que la pipette aspire le milieu de culture, commencez la capture individuelle des cellules somatiques. Concentrez-vous sur le bas de la micro-chute, où différentes morphologies cellulaires sont visibles.

Placez la pointe de la micropipette à côté de chaque cellule somatique, et aspirez sous pression négative. Collectez toutes les cellules rondes et allongées, quelle que soit leur taille. Après avoir collecté 10 cellules, déposez-les dans une micro-goutte de 10 microlitres située sur la surface supérieure du couvercle de la vaisselle.

Conservez toutes les cellules somatiques collectées dans cette micro-chute pendant tout le processus de collecte. Une fois le nombre désiré de cellules somatiques collecté, effectuez une procédure de lavage simple à l’aide de micro-gouttes pour éliminer les spermatozoïdes, les débris et les contaminants microbiens. À l’aide d’un second couvercle pour vaisselle, effectuez un lavage séquentiel en trois étapes des cellules somatiques.

Utilisez une micropipette pour transférer les cellules somatiques dans la première goutte, et laissez-les reposer pendant trois à cinq minutes. Transférez les cellules de la première goutte à la seconde en suivant la même procédure. Répétez le transfert une fois de plus et placez les cellules somatiques dans la troisième goutte.

Enfin, déposer les cellules somatiques isolées dans une micro-goutte préparée destinée au transfert nucléaire des cellules somatiques. La technique de micro-aspiration a permis de récupérer avec succès des cellules somatiques à partir du sperme équin cryopréservé, avec des taux de capture allant de 317,7 à 424,7 cellules par heure sur trois étalons. L’étalon numéro 3 montre le rendement le plus élevé.

Cinq types de cellules somatiques distincts ont été identifiés en fonction de leur taille et de leur morphologie. Nous avons identifié une population de cellules somatiques qui diffère par la morphologie et la viabilité du sperme équin cryopréservé, qui pourrait être utile comme donneur nucléaire. Les cellules peuvent être sélectionnées en fonction de leur morphologie, et la procédure ne nécessite pas l’établissement d’une culture primaire.

Nous nous concentrerons sur l’amélioration de la viabilité de ces cellules après la masse du sperme équin.