Coloration par peroxysome dans les cellules de mammifères à l’aide de sondes spécifiques aux peroxysomes

Notre recherche porte donc sur la compréhension des peroxysomes, qui sont des organites essentiels au métabolisme lipidique et à l’équilibre oxydatif cellulaire. Nous visons à découvrir comment leur structure et leur fonction sont régulées et comment ces processus évoluent dans les maladies. Pour y parvenir, nous développons des sondes fluorescentes qui nous permettent, ainsi qu’à la communauté scientifique au sens large, de visualiser les peroxysomes dans une gamme de cellules animales.

Ici, nous développons des protocoles de coloration qui fonctionnent aussi bien dans les cellules vivantes que fixes, fournissant des outils puissants pour étudier la biologie de la paroxétine en santé et en pathologie. L’un des principaux défis expérimentaux est d’obtenir un marquage non invasif des peroxysomes dans les cellules animales. Bien que la coloration par anticorps aide à surmonter cela, il y a un manque d’anticorps commerciaux pour les protéines paroxystiques.

Un autre défi est de visualiser les peroxysomes de manière non invasive en temps réel, ce qui nécessite des protocoles adaptables. Enfin, la coloration conventionnelle ne fournit pas de lecture fonctionnelle. Bien que la coloration à base de peroxydase puisse varier selon la fonction paroxystique, ce qui est à la fois un défi et une opportunité, car elle nous permet de distinguer les états fonctionnels paroxysmiques au sein de la cellule.

Commencez par des cellules de mammifères semées la veille dans une assiette avec des couvertures qui sont maintenant à une confluence de 30 à 70 %. Diluez la sonde peroxysome avec un nouveau milieu dans un tube microcentrifugé sensible à la lumière pour obtenir une concentration finale de quatre micromolaires. Sélectionnez le puits souhaité à teindre et étiquetez l’extérieur à l’aide d’un marqueur.

Aspirez 0,5 millilitre de média du puits sélectionné et remplacez-les par le média de sonde préparé, goutte par goutte le long de la paroi du puits. Après la délivrance, couver les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. À partir de ce moment, protégez les cellules de la lumière avec du papier aluminium.

Après l’incubation, retirez soigneusement le milieu taché et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, placez la plaque sous une hotte chimique, ajoutez 4 % de paraformoldéhyde dans le PBS aux cellules, puis incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Après fixation, retirez le paraformoldéhyde dans un contenant à déchets désigné et lavez les cellules une fois avec du PBS.

Ensuite, ajoutez 0,5 % de Triton X dans le PBS pour perméabiliser les cellules et les incuber pendant 2,5 minutes. Après l’incubation, retirez le Triton X et lavez les cellules deux fois avec du PBS pendant 10 minutes chacune. Pour bloquer les cellules, incubez-les avec de l’albumine sérique bovine à 5 % dans du PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Effectuer la coloration immunofluorescente selon le protocole standard. Enfin, effectuer une microscopie pour acquérir des images de cellules fixes et vivantes. La coloration des cellules vivantes avec des sondes Peroxi_SPY a entraîné une importation dépendante de la sous-famille D de cassettes liant l’ATP dans les peroxysomes, produisant un rapport de fluorescence peroxysome/cytoplasme élevé dans les cellules métaboliquement actives.

Dans les cellules HEK-293T de type sauvage exprimant GFP-SKL, la coloration Peroxi_SPY555 a montré une localisation distincte avec des peroxysomes, tandis que dans les cellules knockout PEX19 dépourvues de peroxysomes, la coloration était absente. Chez les fibroblastes humains, Peroxi_SPY coloration colocalisée avec le marqueur paroxystique GFP-SKL, confirmant le ciblage peroxysome. La quantification de la densité des peroxysomes a révélé une variation significative entre différents types cellulaires.

Des conditions de coloration optimisées dans les cellules COS-7 utilisant des Peroxi_SPY nanomolaires de 250 pendant 20 minutes ont considérablement augmenté le rapport fluorescence peroxysome/cytoplasme par rapport au protocole initial micromolaire pendant 10 minutes. Une incubation prolongée des cellules HEK-293T avec Peroxi_SPY pendant 24 heures a conduit à un rapport d’intensité de fluorescence peroxysome/cytoplasme amélioré par rapport à 15 minutes, malgré une coloration par peroxysome réduite. Un protocole de fixation a permis un costaining réussi par anticorps, démontré par un marquage Peroxi_SPY préservé et une immunocoloration anti-PEX14 dans les cellules HuH-7 et HEK-293T.

La quantification a montré que les procédures de fixation et de perméabilisation affectaient l’intensité de la fluorescence des peroxysomes par rapport à la coloration des cellules vivantes. Nous avons développé le colorant Peroxi_SPY qui peut être utilisé pour visualiser les peroxysomes dans des cellules animales vivantes et fixes. Notre sonde fluorescente peut offrir une méthode simple et rapide pour étudier la dynamique des peroxysomes, l’hétérogénéité et les dysfonctionnements de manière auparavant limitée.

Ce protocole permettra la recherche par imagerie basée sur les peroxysomes dans divers types cellulaires, y compris les cellules dérivées des patients atteints de troubles paroxystiques.