Méthode à microbilles magnétiques rapides pour la purification efficace de neutrophiles de faible densité
November 11th, 2025
Les neutrophiles de basse densité (LDN) augmentent considérablement dans plusieurs maladies. Les LDN sont généralement isolés par tri cellulaire. Nous présentons une méthode pratique pour obtenir de la NDT pure et viable. Après la centrifugation du sang périphérique par gradient de densité, les cellules sont incubées avec des microbilles magnétiques, puis la LDN est séparée par des colonnes magnétiques.
Nous étudions les neutrophiles de faible densité dans les cellules mononucléaires du sang périphérique afin de caractériser leurs fonctions afin de définir leur rôle dans différentes maladies. Les neutrophiles de faible densité sont rares dans le sang sain, mais ils augmentent nettement les maladies telles que le lupus érythémateux systémique et le cancer. Pour commencer, ajoutez 10 unités par millilitre d’héparine comme anticoagulant dans un tube centrifugeuse conique de 15 millilitres.
Ensuite, ajoutez deux millilitres de dextran T500 à 6 % dans des PBS. Obtenez 10 millilitres de sang d’un volontaire adulte en bonne santé par ponction venébrale. Dans un autre tube centrifugeuse neuf de 15 millilitres, ajoutez cinq millilitres de milieu à gradient de densité.
Faites soigneusement une pipette pour extraire le plasma sans toucher aux érythrocytes et superposez-le sur le milieu pour former deux phases distinctes. Centrifugez le tube à 516 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Pour isoler les PBMC, aspirez et éliminez le plasma au-dessus de la bande PBMC sans perturber les cellules.
Collectez la bande de cellules mononucléaires entre le plasma et le milieu, minimisant ainsi la collecte du milieu. Ajoutez 20 millilitres de PBS dans le tube contenant les PBMC, puis centrifugez à 400 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez soigneusement le surnageant et grattez le tube pour séparer le pellet.
Ajoutez 10 millilitres de PBS froid pour resuspendre les cellules. Pour isoler les neutrophiles, grattez le tube pour séparer les cellules après avoir pipeté le milieu. Ajoutez ensuite 10 millilitres de PBS froid.
Transférez maintenant les cellules dans un nouveau tube centrifugeuse conique de 50 millilitres et centrifugeuse. Aspirez le surnageant et grattez à nouveau le tube. Maintenant, pipettez 10 millilitres de solution hypotonique froide dans le tube et mélangez doucement.
Mélangez doucement pendant exactement une minute. Ajoutez rapidement 10 millilitres de solution hypertonique froide pour rendre la solution isotonique. Ensuite, comptez les neutrophiles à l’aide d’une chambre de Neubauer et assurez-vous que la pureté dépasse 95 %. Centrifugez la suspension pour obtenir un granule cellulaire.
Ensuite, resuspendez la pellete dans du PBS froid. Centrifugez les cellules mononucléaires du sang périphérique à 400 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, resuspendez les cellules dans 120 microlitres de tampon à lavage à froid.
Ensuite, on pipete 35 microlitres de microperles magnétiques CD66b à la suspension cellulaire. Incubez le mélange dans le noir à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Maintenant, pipettez un millilitre de tampon à froid jusqu’au tube.
Centrifugez le tube à 400 g pendant trois minutes. Grattez le tube pour séparer la pelote cellulaire après avoir retiré le surnageant. Et la resuspension des cellules dans un millilitre de tampon de lavage.
Placez une colonne de séparation magnétique sur un aimant. Ajoutez 0,5 millilitres de tampon de lavage à la colonne, ce qui permet de passer complètement. Transférez un millilitre des cellules en suspension sur la colonne et laissez passer le tampon goutte par goutte.
Après lavage, transférez la colonne dans un tube de microcentrifuge. Ensuite, pipettez un millilitre de tampon de lavage dans la colonne. Maintenant, insérez le ventouse sur le dessus de la colonne.
Appliquez doucement une pression pour éluer les cellules. Ensuite, retirez le plongeur et placez la colonne sur un nouveau tube de microcentrifugeuse. Ajoutez un millilitre supplémentaire de tampon de lavage à la colonne.
Ensuite, insérez à nouveau le plongeur et appliquez doucement une pression pour éluer les cellules restantes. Centrifugez les deux tubes de microcentrifuge à 800 g pendant trois minutes. Resuspendez les granulés de cellules des deux tubes dans un millilitre de PBS froid.
Gardez la suspension de la cellule sur glace. Resuspendez les cellules purifiées dans un tampon de marquage composé de sérum bovin fœtal à 1 % dans PBS. Transférez 250 microlitres de la suspension dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Ajoutez les anticorps correspondants contre les molécules de membrane neutrophile au tube. Ensuite, incubez les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, protégées de la lumière. Maintenant, pipettez un millilitre de PBS dans le tube.
Faites tourner le tube dans une microcentrifugeuse à 800 g pendant trois minutes. Aspirez le surnageant. Tapez sur le tube pour casser la pastille.
Et resuspendez les cellules à 0,5 millilitre de 1 % de paraformoldéhyde. Ensuite, maintenir les cellules à quatre degrés Celsius, protégées de la lumière jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux. Analysez les échantillons à l’aide de la cytométrie en écoulement, en capturant 10 000 événements par échantillon.
Les neutrophiles de faible densité chez les individus sains représentaient environ 5 % des cellules mononucléaires du sang périphérique, tandis que le protocole d’isolation magnétique décrit a révélé des neutrophiles de faible densité à environ 98 % de récupération. Les neutrophiles expriment les marqueurs membranaires CD10, CD11b, CD15, CD62L et CD66b. Les neutrophiles de basse densité purifiés magnétiquement exprimaient les mêmes marqueurs membranaires que les neutrophiles.
Les neutrophiles purifiés à faible densité présentaient un noyau multilobulé et étaient de taille similaire aux neutrophiles. Les neutrophiles et les neutrophiles de basse densité ont tous deux généré des espèces réactives d’oxygène en réponse à la stimulation de la PMA, les neutrophiles de faible densité produisant des niveaux plus élevés que les neutrophiles. Les neutrophiles de faible densité ont libéré des pièges extracellulaires neutrophiles en réponse à la stimulation du PMA, comme en témoigne la localisation de l’ADN avec de l’élastase et de la citrulline.
Les neutrophiles purifiés et les neutrophiles de faible densité ont tous deux libéré des NETs avec une cinétique et des quantités similaires après le traitement PMA. Notre protocole offre un moyen rapide et reproductible d’obtenir des neutrophiles de faible densité hautement purs et fonctionnels. Nous abordons l’absence d’un protocole standardisé et efficace en termes de temps pour l’isolement des neutrophiles de faible densité du sang humain.
Ce protocole ne nécessite aucune formation spéciale pour des instruments complexes, et il est aussi plus économique et plus rapide que le FACS.
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Aperçu
Cette étude se concentre sur les neutrophiles à faible densité (LDN) trouvés dans les cellules mononucléées du sang périphérique, qui sont rares chez les individus en bonne santé mais augmentent significativement dans diverses maladies. L'article présente une méthode pratique pour isoler des LDN purs et viables grâce à la centrifugation sur gradient de densité et aux techniques de séparation magnétique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- Les neutrophiles à faible densité sont associés à des maladies comme le lupus érythémateux disséminé et le cancer.
- Comprendre les LDN peut fournir des informations sur leurs rôles dans les mécanismes des maladies.
- L'isolement des LDN est crucial pour étudier leurs fonctions et leur potentiel thérapeutique.
- Les méthodes actuelles pour l'isolement des LDN peuvent ne pas produire des cellules pures et viables.
Objectif de l'étude
- Caractériser les fonctions des neutrophiles à faible densité.
- Définir le rôle des LDN dans diverses maladies.
- Présenter une méthode efficace pour isoler les LDN du sang périphérique.
Méthodes utilisées
- Utilisation de l'héparine comme anticoagulant dans la collecte de sang.
- Application de dextran T500 pour la séparation par gradient de densité.
- Incubation avec des microbilles magnétiques pour le tri cellulaire.
- Séparation des LDN à l'aide de colonnes magnétiques.
Résultats principaux
- La méthode isole avec succès des neutrophiles à faible densité purs et viables.
- Les LDN peuvent être caractérisés pour leurs rôles fonctionnels dans la maladie.
- Une meilleure compréhension des LDN peut mener à de meilleures stratégies thérapeutiques.
- La technique d'isolement peut être appliquée à divers contextes de recherche.
Conclusions
- L'isolement des LDN est essentiel pour étudier leur impact sur la santé et la maladie.
- La méthode présentée améliore la pureté et la viabilité des cellules isolées.
- Des recherches supplémentaires sur les LDN peuvent contribuer aux avancées en immunologie et aux approches thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
