Détermination de la biomasse microbienne dans le sol à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR)

Notre étude utilise la PCR numérique par gouttelettes et le séquençage du génome entier pour quantifier avec précision la biomasse microbienne sur différents types de sols. Les méthodes conventionnelles nécessitent de grands échantillons de sol et des produits chimiques nocifs. ddPCR utilise un minimum de sol pour la quantification absolue du gène et du carbone de biomasse.

Pour commencer, assemblez les réactifs du kit d’extraction d’ADN du sol pour isoler l’ADN des microbes du sol à 20 degrés Celsius à température ambiante. Faites tourner brièvement le tube de battage de billes de deux millilitres et vérifiez que les billes se sont stabilisées au fond. Ajoutez 100 milligrammes de terre, puis 800 microlitres de solution CD1 et faites un vortex brièvement pour mélanger.

Utilisez un homogénéisateur de broyeur à billes à une vitesse de six mètres par seconde pendant 40 secondes pour lyser l’échantillon en profondeur et centrifugez le tube de battage de billes à 15 000 g pendant une minute à température ambiante pour obtenir une lyse mécanique des cellules. Transférez le surnageant qui peut encore contenir des particules de sol dans un tube de microcentrifuge propre de deux millilitres. Ajoutez 200 microlitres de solution CD2.

Vortex pendant cinq secondes et centrifugeuse à 15 000 g pendant une minute. Transférez jusqu’à 700 microlitres de surnageant dans un tube de microcentrifuge propre de deux millilitres sans déranger la pellete. Ajoutez 600 microlitres de solution CD3 au surnageant et au vortex pendant cinq secondes.

Chargez 650 microlitres du mélange sur une colonne de rotation et centrifugez à 15 000 g pendant une minute. Abandonnez le flux et répétez le processus pour le lysat restant. Ensuite, placez la colonne de centrifugation dans un tube de collecte propre de deux millilitres.

Ajoutez 500 microlitres de solution EA à la colonne de rotation et centrifugez à 15 000 g pendant une minute à température ambiante. Jetez le filtre de passage et remettez la colonne de rotation dans le même tube de collecte. Ajoutez 500 microlitres de solution C5 à la colonne de rotation et à la centrifugeuse comme démontré précédemment.

Après avoir retiré le flux direct, placez la colonne de rotation dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et centrifugez à 16 000 g pendant deux minutes à température ambiante. Placez la colonne de rotation dans un nouveau tube d’élution de 1,5 millilitre. Ajoutez de 50 à 100 microlitres de la solution C6 au centre de la membrane filtrante de la colonne de spin.

Centrifugez à 15 000 g pendant une minute. Stockez le tube contenant l’élusive à quatre degrés Celsius après avoir écarté la colonne de spin. Quantifiez l’ADN extrait à l’aide d’un fluoromètre et d’un kit de test à large portée à double brin en suivant les instructions du fabricant.

Pour l’analyse des bactéries et des champignons, sélectionnez des amorces spécifiques à 16S rRNA et 18S rRNA. Après dégel, concentrez tous les réactifs sur la glace. Configurez la réaction en chaîne par polymérase par gouttelettes numériques, ou ddPCR.

Placez la cartouche génératrice de gouttelettes, ou DG8, dans le porte-cartouche. Ajoutez un total de 20 microlitres du mélange de réaction dans chacun des puits d’échantillonnage de la cartouche. Ajoutez ensuite 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes pour Evagreen dans l’huile bien étiquetée de la cartouche.

Placez la cartouche dans le générateur de gouttelettes et couvrez-la avec un joint d’étanchéité. Transférez 40 microlitres des gouttelettes générées dans chaque puits d’une plaque semi-jupe de 96 puits pour l’amplification par PCR. Scellez la plaque à l’aide d’un scellant préréglé à 180 degrés Celsius pendant cinq secondes.

Configurez le profil de cycle thermique et réglez le couvercle chauffé à 105 degrés Celsius. Après la fin de la PCR, transférez la plaque à 96 puits vers le lecteur de plaques. En utilisant la version 2.1 de QuantaSoft, ajustez le seuil d’amplitude pour séparer les gouttelettes négatives et positives.

À partir de chaque puits, évaluez les paramètres, tels que le nombre de copies de gènes par nanogramme d’ADN, le nombre total de copies de gènes par nanogramme d’ADN extrait, les copies de gènes par gramme de poids sec du sol traité lors de l’extraction, et le nombre de cellules par gramme de poids sec du sol. De plus, calculez le carbone microbien de biomasse, ou MBC, correspondant aux bactéries et champignons par gramme de poids sec de sol par puits. L’analyse triplicée de l’ADN du sol à cinq endroits a révélé des concentrations moyennes d’ADN microbien allant de 32 nanogrammes à 4 590 nanogrammes par gramme de sol sec et par échantillon.

Le sol B contenait le moins de copies du gène 16S rRNA, soit en moyenne 8,8 fois 10, soit la puissance de sept, et 18 copies du gène rRNA 18S, soit une moyenne de 4,6 fois 10, soit six par gramme de sol sec. En revanche, le sol E a obtenu les plus grands décomptes de copies des gènes d’ARNr 16S et 18S, avec une moyenne de 4,4 fois 10 à la puissance de neuf et 2,5 fois 10 à la puissance de neuf par gramme de sol sec, différenciant significativement de tous les autres échantillons. Bien que les copies fongiques soient restées similaires sur les sols A, B, C et D, les décomptes bactériens dans le sol D différaient significativement de ceux du sol B et de l’E. La teneur microbienne la plus élevée a été observée dans le sol E, tandis que la plus faible teneur microbienne a été trouvée dans des échantillons prélevés dans le sol B différant significativement de ceux de A, D et E. Ce protocole permet aux chercheurs de mesurer la dynamique et la structure des communautés du sol grâce à la biomasse microbienne et au ratio fongique/bactérien.

Le même ADN modèle utilisé pour la PCR numérique en gouttelettes peut être utilisé pour le séquençage de l’ADN afin de permettre l’analyse de la communauté microbienne et de la fonction.