Imagerie calcique basée sur la fluorescence dans les cultures épithéliales primaires des voies respiratoires humaines utilisant la segmentation cellulaire automatisée

Les transcriptomiques unicellulaires révèlent une hétérogénéité dans l’épithélium des voies respiratoires de la mucoviscidose kystique. Nous avons l’intention de comprendre comment les fonctions et changements spécifiques aux types cellulaires affectent la pathogenèse de la maladie. Le défi actuel est de mesurer avec précision la protéomique et les fonctions unicellulaires.

Cela nécessite encore un développement technique. Pour commencer, maintenez les cellules de Calu-3 dans des flasques T-25 contenant le milieu de culture Minimum Essential Medium d’Eagle, complétés par 20 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine. Lorsque les cellules atteignent environ 70 % de confluence, lavez-les avec cinq millilitres de PBS.

Après le lavage, ajoutez un millilitre de TrypLE directement sur les cellules et placez la fiole dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, neutralisez le TrypLE en ajoutant quatre millilitres de milieux de culture frais et complets et mélangez soigneusement la suspension cellulaire. Placez les cellules dans une plaque de 96 puits à une confluence d’environ 90 % à 100 %, correspondant à environ 40 000 cellules par puits.

Laissez les cellules adhérer à la plaque à 96 puits toute la nuit. Changez le milieu chaque jour et continuez à cultiver les cellules pendant deux à cinq jours après la confluence pour permettre la différenciation. Le jour de l’expérience, lavez les cellules de Calu-3 et incubez-les avec les colorants appropriés.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres par puits de probénécide 2,5 millimolaires dilué dans un tampon de calcium pour maintenir le colorant dans l’espace cytoplasmique et enveloppez la plaque dans du papier aluminium pour la protéger de la lumière jusqu’à l’imagerie. Pour les cellules primaires des voies respiratoires. Retirez le milieu basolatéral du puits de trans et lavez le côté apical en ajoutant 300 microlitres de tampon calcique.

Ensuite, lavez le côté basolatéral en ajoutant 750 microlitres de tampon calcique. Retirez le tampon en pipettant et répétez le lavage une fois de plus des deux côtés. Ensuite, incubez les cellules avec 200 microlitres de solution de colorant du côté apical et 600 microlitres du côté basolatéral pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Pendant l’incubation, préparez de la thapsigargine diluée dans un tampon de calcium comme un stock intermédiaire trois fois. Ajustez la concentration à six micromolaires pour obtenir une concentration finale de deux micromolaires dans le puits. Après l’incubation, retirez la solution de colorant des compartiments apicaux et basolatéraux par pipetage.

Lavez les cellules deux fois avec 300 microlitres de tampon de calcium du côté apical et 750 microlitres de tampon de calcium du côté basolatéral. Ensuite, retirez le tampon en pipettant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de probénécide 2,5 millimolaires dans un tampon calcique dans le compartiment apical, et ajoutez 500 microlitres de la même solution dans le compartiment basolatéral.

En gardant l’insert transwell à l’intérieur de la plaque, enveloppez toute la plaque dans du papier aluminium pour la protéger de la lumière, puis mettez la plaque enveloppée de côté pour l’imagerie. Ouvrez la demande fidjienne. Sélectionnez Fichier et choisissez Ouvrir pour télécharger le fichier vidéo.

Dans la fenêtre contextuelle qui en résulte, conservez tous les paramètres par défaut et confirmez la sélection. Si désiré, ajustez l’affichage de l’image en sélectionnant Image, en choisissant Ajuster, puis en cliquant sur Contraste de luminosité. Modifiez la luminosité et le contraste des canaux de fluorescence individuels pour obtenir une vue optimale des cellules.

Pour faciliter le traçage des cellules, fusionnez les canaux en sélectionnant Image, en choisissant Couleur, puis en cliquant sur Fusionner les canaux. Dans la fenêtre contextuelle, assignez les fichiers appropriés à chaque canal individuel et confirmez la sélection. Pour le traçage, sélectionnez Analyser, Choisir Outils et ouvrir le ROI Manager.

Dans la fenêtre contextuelle qui en résulte, activez à la fois les options Afficher tout et les étiquettes. À l’aide de l’outil de sélection à main levée, suivez soigneusement les cellules individuelles en fonction des limites cellulaires et de la coloration nucléaire. Ensuite, appuyez sur la touche T pour ajouter chaque cellule tracée à la liste ROI.

Assurez-vous que les cellules sont tracées dans les quatre coins du champ de vision et au centre de la vidéo. Une fois toutes les cellules correctement tracées, dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, cliquez sur Plus et sélectionnez Multi Mesures. Dans la fenêtre pop-up qui en résulte, appuyez sur OK pour commencer la mesure.

Ouvre le fichier vidéo aux Fidji. Optimisez les canaux de fluorescence nucléaire et verte pour la visualisation à l’aide des outils d’ajustement d’image. Une fois les canaux optimisés, dupliquez une seule image en sélectionnant Image et en choisissant Dupliquer.

Dans la fenêtre contextuelle qui en résulte, désélectionnez « Dupliquer la pile » et enregistrez l’image dupliquée sous forme de fichier image PNG. Répétez la duplication d’image pour l’autre canal en sélectionnant Image et en choisissant Dupliquer. Dans la fenêtre pop-up, appuyez sur OK, et sauvegardez l’image pour un fichier PNG.

Fusionnez les deux images enregistrées en sélectionnant Image, en choisissant Couleur, puis en cliquant sur Fusionner les canaux. Ensuite, assignez chaque fichier PNG au canal approprié et confirmez la fusion. Téléchargez l’image fusionnée dans l’interface graphique de la cellule pour générer un masque cellulaire.

Segmentez l’image en utilisant la coloration nucléaire comme canal un et la coloration cytoplasmique comme canal deux en sélectionnant le modèle cyto3. Maintenant, enregistrez l’image du masque générée sous forme de fichier PNG. Ouvrez-le aux Fidji et convertissez-le en fichier TIFF.

Enfin, ouvrez à la fois le fichier masque et le fichier vidéo original dans la suite calcium en les faisant glisser et déposer dans l’interface logicielle. Cliquez sur Analyser les données pour générer un graphique téléchargeable et un fichier CSV téléchargeable contenant les valeurs d’intensité normalisées et brutes pour toutes les cellules analysées. L’intensité de fluorescence normalisée à la base a augmenté au fil du temps chez les cellules Calu-3 individuelles après stimulation de la thapsigargine lorsqu’elle est mesurée à la fois avec Fluo-4 AM et Cal-520 AM, l’activation maximale de la fluorescence dépendante du calcium après thapsigargine était significativement plus élevée dans les cellules Calu-3 mesurées avec Cal-520 AM comparé à Fluo-4 AM. De même, les cellules primaires des voies respiratoires et bronches individuelles ont montré une fluorescence normalisée accrue au fil du temps après la stimulation de la thapsigargine avec l’un ou l’autre des colorants.

De plus, l’activation maximale de la fluorescence dépendante du calcium était significativement plus élevée dans les cellules chargées en Cal-520 AM. L’analyse basée sur l’apprentissage automatique a identifié et quantifié les variations de fluorescence dépendantes du calcium dans 1 441 cellules individuelles, à partir d’un champ de vision unique. Les traces de fluorescence normalisées générées par le logiciel ont montré des réponses calciques pour les 1 441 cellules identifiées après stimulation de la thapsigargine. Nos études aideront à comprendre les réponses des différents types cellulaires à leur environnement, ce qui favorisera le développement de traitements ciblés.

Nos résultats ont le potentiel de cibler des types cellulaires distincts, d’attribuer certaines réponses de cellules vivantes à des stimuli environnementaux. À l’avenir, nous avons l’intention d’explorer comment la signalisation spécifique à un type cellulaire dans les cellules maladies et saines est modifiée afin de déterminer les types responsables.