Installation reproductible pour l’imagerie à deux photons in vivo de la contractilité des vaisseaux lymphatiques cervicaux et du flux lymphatique chez la souris

Nous présentons la nécessité d’une nouvelle imagerie de la contractilité des vaisseaux lymphatiques cervicales et de l’ablation lymphatique des globules rouges chez la souris. L’étude des fonctions des vaisseaux lymphatiques cervicaux est un défi, notamment lorsqu’une observation à long terme de la contractilité du flux lymphatique et des circulations tracantes est nécessaire. Pour commencer, placez un rail optique en acier mesurant 270 millimètres de long et 43 millimètres de large comme base de l’appareil.

Installez deux porte-poteaux sur le dessus du rail optique en acier, en assurant une distance de 175 millimètres entre eux. Insérez deux supports de montage de 12 millimètres dans les porte-poteaux et fixez-les chacun à l’aide d’une vis M6. Ensuite, fixez un collier de poteaux à chacun des deux montants.

Fixez un serre-poste fixe à angle droit sur l’un des montants de fixation et fixez-le fermement à l’aide d’une vis M6. Insérez un support de montage de 12 millimètres dans le trou latéral de la pince de poteau à angle droit. Fixez un support imprimé en 3D sur le support latéral inséré et fixez-le solidement à l’aide de deux paires de vis M3.

À l’aide de colle UV, fixez un verre de couverture de 12 millimètres de diamètre sous un boîtier protecteur imprimé en 3D. Ensuite, fixez le boîtier de protection au support imprimé en 3D à l’aide d’une paire de vis/écrou M4. Installez une table pantographe de précision pour le mouvement vertical sur la base du rail optique en acier à l’aide de deux clips de table et de jeux de vis, écrous et rondelles M6.

Ensuite, posez un boîtier imprimé en 3D mesurant 155 millimètres de long et 110 millimètres de largeur sur la table. Cette vitrine sert de réservoir pour l’accumulation de solution saline. Couvrez le point de connexion des fils à l’élément chauffant un avec une fine couche de silicone.

Fixez le capteur de température un sur le tapis et scellez-le avec du silicone. Soudez les fils de l’élément chauffant et des capteurs de température sur un câble multi-fils. Remplissez le point de connexion avec du silicone et refermez-le avec du film rétractable.

Placez l’élément chauffant deux et le capteur de température deux dans le rouleau en mousse. Fixez les connecteurs du câble d’alimentation et du bouton d’alimentation aux parois du boîtier de l’unité de contrôle. Installez une alimentation en courant continu de 24 volts, un convertisseur abaisseur à courant continu et deux modules MOSFET à l’intérieur de l’enceinte.

Après avoir assemblé le circuit et soudé les composants nécessaires, fixez l’Arduino Uno et l’écran du clavier dans le boîtier du couvercle. Localiser le champ de sélection de température. Ajustez la température et appuyez sur la piste.

Après avoir anesthésé la souris, appliquez une pommade oculaire sur les deux paupières pour éviter que les globes oculaires ne sèchent lors de l’opération. Une fois que le réflexe de retrait de la patte arrière et le réflexe de repli de la queue ont cessé, placez la souris sur le dos sur l’élément chauffant pour permettre l’accès à la région abdominale. Branchez l’unité de commande sur une prise électrique avec une tension d’entrée de 175 à 240 volts en courant alternatif.

À l’aide d’un ruban médical, fixez le corps de l’animal parallèlement à la surface de la table, puis placez la tête en angle par rapport à l’axe sagittal, de sorte qu’un côté du cou repose sur le rouleau. Enroulez une ligature autour des incisives supérieures et fixez-la à l’arrière de l’appareil et utilisez du ruban médical pour aider à maintenir la température corporelle de l’animal. Ensuite, rase la fourrure de la région du cou.

Ensuite, retirez les poils restants et couvrez l’animal pour préserver le champ stérile. Pour la désinfection primaire, désinfectez la peau du cou à l’aide d’un écouvillon d’alcool. Ensuite, appliquez une solution de chlorhexidine à 0,5 % ou une solution d’iode à 2 % pour le traitement antiseptique, puis répétez la désinfection deux fois de plus.

Après confirmation de la profondeur anesthésiante par réflexe de pincement des orteils, effectuer une dermatotomie en pratiquant une incision longitudinale le long de la peau du cou, de la mâchoire inférieure à la clavicule, d’environ deux centimètres de long. Ensuite, réalisez une fasciotomie à l’aide de ciseaux courbes microchirurgicaux. À l’aide d’une pince courbée, poussez doucement les glandes salivaires et les muscles superficiels du cou pour exposer le muscle sternocléidomastoïdien.

Veillez à ce que les vaisseaux sanguins visibles ne soient pas endommagés et humidifiez continuellement le champ chirurgical avec du sérum physiologique pour éviter les dommages tissulaires. Utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour effectuer une myotomie du muscle sternocléidomastoïdien, permettant ainsi d’accéder à la région entre la trachée et l’artère carotide. Continuez à écarter les muscles et le fascia, en réalisant à la fois une myotomie et une fasciotomie.

Ensuite, localisez le ganglion lymphatique cervical profond ainsi que les vaisseaux lymphatiques afférents et efférents à une profondeur de cinq à sept millimètres. Placez l’appareil tenant l’animal fixe sur la table mobile du microscope. Et fixez l’appareil en le fixant fermement avec une vis M6 pour assurer la stabilité lors de l’imagerie.

Fixez le cathéter, prérempli de solution saline, au poteau de fixation à l’aide d’un ruban médical. Placez un rouleau d’un centimètre de diamètre sous l’élément chauffant sur le côté de la tête de l’animal pour maintenir une inclinaison de 45 degrés par rapport à la table du microscope. Ensuite, placez le cathéter fixe dans la zone du cou ouverte chirurgicalement de façon à ce qu’il soit près de la clavicule de l’animal, puis activez l’apport en solution saline pour remplir la cavité nucalaire ouverte avec une solution saline.

Abaissez la coque protectrice sur la zone du cou, remplie de solution saline, de sorte que le vaisseau lymphatique soit au centre du champ d’observation. Ensuite, placez la coque protectrice sur la trachée sans exercer de pression. Enfin, abaissez la lentille à deux photons non immersive dans l’eau dans le boîtier protecteur à la bonne profondeur selon la distance de travail du cristallin et effectuez une visualisation à deux photons du vaisseau lymphatique cervical.

Après l’intervention, l’identification réussie des ganglions lymphatiques cervicales profonds a été confirmée par une accumulation d’Evans Blue dans le tissu. La surveillance à deux photons de la contractilité du vaisseau lymphatique cervical a été réalisée avant et après la photobiomodulation. La photobiomodulation a considérablement augmenté la contractilité du vaisseau lymphatique cervical chez les souris de 2 et 18 mois d’intensité similaire.

L’analyse quantitative a montré que la contractilité des vaisseaux lymphatiques cervicaux était significativement plus faible chez les souris de 24 mois comparée à celles de 2 et 18 mois. Cependant, les valeurs n’étaient pas significativement différentes entre les souris de 2 et 18 mois. La photobiomodulation a significativement augmenté la contractilité des vaisseaux lymphatiques cervicaux chez les souris de 2 et 18 mois, mais n’a eu aucun effet chez les souris de 24 mois.

Les globules rouges injectés dans le ventricule latéral droit ont été observés dans les vaisseaux lymphatiques cervicales quatre heures après l’injection et ont continué à circuler dans la lumière à cinq heures, confirmant le flux directionnel du cerveau vers la périphérie. Notre protocole facilite la surveillance in vivo de la fonction des vaisseaux lymphatiques cervicaux tout en maintenant la contractilité pendant jusqu’à cinq heures d’observation. Notre méthode offre une bonne reproductibilité et est compatible avec divers microscopes à deux photons et objectifs tout en maintenant une image de haute qualité avec des profondeurs allant jusqu’à 500 micromètres.

Cette technique peut potentiellement devenir un outil universel pour étudier la physiologie du système de drainage cérébral et les fonctions des vaisseaux lymphatiques cervicaux.