Approche multimodale pour évaluer la régénération osseuse et la performance de l’échafaudage

Nos recherches évaluent comment différents biomatériaux influencent-cee-atent l’architecture osseuse pendant le processus de régénération. La régénération osseuse nécessite une évaluation à plusieurs échelles, car il s’agit d’un tissu hiérarchiquement organisé. Ce protocole permet l’analyse de l’échantillon à différentes échelles.

Pour commencer, fixez le tibia incrusté dans la résine contenant le biomatériau implanté sur le porte-échantillon et fixez-le au bras instrumentaire. Orientez l’échantillon selon la direction de coupe souhaitée. Obtenez un disque de scie diamant à basse vitesse pour sectionner l’os en tranches d’environ 0,7 millimètre.

Remplissez le réservoir de liquide jusqu’à ce que le niveau de liquide recouvre complètement le bord inférieur de la pale. Assurez-vous que l’échantillon est stable et aligné horizontalement avec la surface du disque. Ajustez la position de l’échantillon à l’aide des boutons de positionnement jusqu’à ce que la zone de coupe cible soit alignée avec la lame.

Commencez à couper l’échantillon en utilisant une vitesse plus élevée et appliquez une pression basse jusqu’à ce qu’une indentation se forme. Ensuite, réduisez la vitesse pour terminer le coupage en douceur et minimiser les vibrations. Arrêtez la scie immédiatement après la coupe.

Ensuite, on examine l’échantillon coupé à l’aide d’un stéréoscopique pour le montage. Pour le montage, utilisez un assemblage fait maison composé d’un cylindre intérieur en acier inoxydable massif et d’un cylindre creux extérieur qui assure un support mécanique lors du polissage. Ensuite, placez le cylindre intérieur sur une plaque chauffante et chauffez-le à environ 120 à 140 degrés Celsius.

Choisissez une cire adaptée et appliquez une petite quantité de cire à la surface du cylindre chauffé pour la laisser fondre complètement. Ensuite, placez l’échantillon avec la surface d’intérêt orientée vers le bas sur la zone recouverte de cire, puis appuyez doucement sur l’échantillon pour assurer un contact complet avec la cire fondue. Ensuite, retirez le cylindre en aluminium de la plaque chauffante et laissez la cire se solidifier à température ambiante.

Pour le polissage grossier et intermédiaire, choisissez du papier sablé avec des granulés de 1, 200, 2, 500 et 4, 100 pour réduire l’épaisseur de l’échantillon à environ 0,15 millimètre. Commencez par 1 papier sablé de 200 grains, suivi de 2 500 grains tout en appliquant une légère pression. Surveillez périodiquement l’épaisseur de l’échantillon pendant le polissage à l’aide de microscopie de réflexion.

Une fois l’épaisseur cible atteinte, polissez les deux côtés de l’échantillon avec du papier sablé 4 grains 100. Nettoyez continuellement l’échantillon avec de l’eau distillée à chaque étape de polissage. Pour le polissage final, choisissez une pâte diamantée de particule de six ou trois micromètres, en fonction de la rugosité de la surface de l’échantillon.

Appliquez une petite quantité de pâte diamantée sur un chiffon de polissage en feutre, monté sur un disque de polissage, puis polez l’échantillon. Pour détacher l’échantillon du cylindre, chauffez la cire sur une plaque chauffante. Après avoir retiré l’appareil de la plaque chauffante, retirez l’échantillon du cylindre.

Ensuite, polissez délicatement les deux côtés de l’échantillon en utilisant une pression minimale et séchez la surface polie avec du papier filtre. Avant l’analyse microscopique, montez l’échantillon entre une lame en verre et un cache-vâton en utilisant de l’huile d’immersion comme support de montage. Examinez l’orientation des fibres de collagène à l’aide de la microscopie à lumière polarisée, en commençant par un faible grossissement entre 5x et 10x.

Enfin, préparez l’échantillon pour la microscopie électronique à balayage afin d’analyser plus en détail l’interface os-biomatériau. Après le polissage et l’examen initial par microscopie optique, les caractéristiques intrinsèques de l’échantillon ont permis de faire correspondre la région identifiée sous microscopie optique à l’emplacement correspondant dans le jeu de données de tomodensitométrie microcalculée. La microscopie à lumière polarisée a différencié l’os préexistant, montré en bleu, de l’os nouvellement formé pendant la cicatrisation, représenté en orange.

Une microscopie à lumière polarisée à un grossissement plus élevé a révélé une interface où l’os se déposait en opposition étroite avec l’os cortical préexistant, avec des fibres de collagène de type I orientées perpendiculairement dans une région fine. L’imagerie par microscopie électronique à balayage permettait de localiser précisément les zones d’intérêt. Un volume de la région sélectionnée a été examiné en détail à l’aide de la tomographie slice-and-view.

La face de la tranchée présentait une morphologie osseuse sur une trabécula en croissance. La microscopie électronique en transmission permet un examen nanométrique de l’interface os-biomatériau, qui peut être combinée avec la diffraction électronique de zones sélectionnées. Les motifs de diffraction électronique en zone sélectionnée ont indiqué que la région biomatérielle et la région osseuse étaient composées de cristaux d’hydroxyapatite.

La cartographie par spectroscopie des rayons X à dispersion d’énergie de la région d’interface imagée a montré phosphore et calcium. Ce flux de travail multimodal offre des perspectives complémentaires qui ne peuvent être obtenues par une seule technique d’imagerie. Ce flux de travail nécessite un temps important, une expertise technique et un accès à des instruments spécialisés.

Il peut étudier les corrélations fonctionnelles, le remodelage osseux à long terme et la conception des biomatériaux.