Name: In Vitro Essai de réassociation pour mesurer la formation de particules ribosomais 80S à l’aide de sous-unités ribosomales lavées au sel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Découvrez la réassociation in vitro de sous-unités ribosomiques lavées au sel pour analyser la formation de particules 80S. Cette méthode permet d'étudier les interactions entre sous-unités 40S et 60S et leur rôle dans la synthèse protéique.

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<ol><li>Hinnebusch, A. G., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation%3A+new+insights+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation: new insights and challenges.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (10), a01154(2012).</li>
<li>Fringer, J. M., Acker, M. G., Fekete, C. A., Lorsch, J. R., Dever, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+release+of+eukaryotic+translation+initiation+factors+5B+and+1A+from+80S+ribosomes+following+subunit+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupled release of eukaryotic translation initiation factors 5B and 1A from 80S ribosomes following subunit joining.</a> Mol Cell Biol. 27 (6), 2384-2397 (2007).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Kisly, I., Tamm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaea%2Feukaryote-specific+ribosomal+proteins%3A+guardians+of+a+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Archaea/eukaryote-specific ribosomal proteins: guardians of a complex structure.</a> Comput Struct Biotechnol J. 21 (1), 1249-1261 (2023).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Gossen, M., Dittmar, G., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+cellular+protein+translation+by+pulsed+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC.</a> Proteomics. 9 (1), 205-209 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Kisly, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+eL19+and+eB12+intersubunit+bridge+in+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The functional role of eL19 and eB12 intersubunit bridge in the eukaryotic ribosome.</a> J Mol Biol. 428 (10 Pt B), 2203-2216 (2016).</li>
<li>Kisly, I., Remme, J., Tamm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+protein+eL24%2C+involved+in+two+intersubunit+bridges%2C+stimulates+translation+initiation+and+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribosomal protein eL24, involved in two intersubunit bridges, stimulates translation initiation and elongation.</a> Nucleic Acids Res. 47 (1), 406-420 (2019).</li>
<li>Tamm, T., Kisly, I., Remme, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+of+ribosomal+intersubunit+bridges+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional interactions of ribosomal intersubunit bridges in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 213 (4), 1329-1339 (2019).</li>
<li>Konikkat, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+60S+ribosomal+subunit+assembly+emerging+from+recent+studies+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Principles of 60S ribosomal subunit assembly emerging from recent studies in yeast.</a> Biochem J. 474 (2), 195-214 (2017).</li>
<li>Steffen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+deficiency+protects+against+ER+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome deficiency protects against ER stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 191 (1), 107-118 (2012).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Getting started with yeast.</a> Methods Enzymol. 350 (1), 3-41 (2002).</li>
<li>Liiv, A., O'Connor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+intersubunit+bridge+regions+of+23S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutations in the intersubunit bridge regions of 23S rRNA.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29850-29862 (2006).</li>
<li>Kipper, K., Hetényi, C., Sild, S., Remme, J., Liiv, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+intersubunit+bridge+B2a+is+involved+in+factor-dependent+translation+initiation+and+translational+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal intersubunit bridge B2a is involved in factor-dependent translation initiation and translational processivity.</a> J Mol Biol. 385 (2), 405-422 (2009).</li>
<li>Lilleorg, S., Reier, K., Remme, J., Liiv, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intersubunit+bridge+B1b+of+the+bacterial+ribosome+facilitates+initiation+of+protein+synthesis+and+maintenance+of+translational+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The intersubunit bridge B1b of the bacterial ribosome facilitates initiation of protein synthesis and maintenance of translational fidelity.</a> J Mol Biol. 429 (7), 1067-1080 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4-(2-hydroxyéthyle)-1-piperazine, acide éthanassulfuronique (HEPES)</td><td>Bioréactifs de Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons de bouteilles centrifugeuses de 70 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>355623</td><td></td></tr><tr><td>Akta UVIS-920-Monitor</td><td>GE Santé</td><td>70407</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&nbsp ; Ultra filtre centrifuge, 100 kDa MWCO, 15 mL</td><td>Millipore</td><td>UFC9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure bacto</td><td>Gibco</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette graduées bleues, 1000 & micro ; L</td><td>TipOne</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration sur le dessus de la bouteille, entonnoir seulement 500 mL</td><td>Starlab</td><td>CC8222-5226</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de mélange magnétique C-MAG HS 7</td><td>IKA</td><td>S000</td><td></td></tr><tr><td>Fresque de biofuge de centrifugeuse</td><td>Heraeus Instruments</td><td>75005510/01</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles centrifugeuses 600 mL</td><td>Hettich</td><td>0551</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Rotina 420R&nbsp ;</td><td>Hettich</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Rotor basculant de centrifugeuse & nbsp ;</td><td>Hettich</td><td>4784-A+4780+4783</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose monohydrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11090.36</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes jetables 1,5 mL</td><td>Plastibrand</td><td>759015</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol (TDT)</td><td>Bioréactifs de Fisher</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Tubes centrifugeuses coniques Falcon 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre (& Oslash ; 0,25-0,5 mm)</td><td>Carl Roth</td><td>A553.1</td><td></td></tr><tr><td>Machine à dégradé volume total 100 mL</td><td>Instruments scientifiques Hoefer</td><td>SG100</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Maker 30 mL volume total &nbsp ;</td><td>Instruments scientifiques Hoefer</td><td>SG30</td><td></td></tr><tr><td>Bloc sec chauffant/refroidissement CH-100</td><td>BioSan</td><td>BS-010410-CAI</td><td></td></tr><tr><td>Vibrateur incubateur Multitron</td><td>Infors HT</td><td>NC1666704</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (C3H7OH)</td><td>Bioréactifs de Fisher</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Azote liquide (N2)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de magnésium tétrahydrate (Mg(OAc)2 & Bull 4H2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7008,0100</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette avec marques circulaires, 100 & micro ; L</td><td>Marienfeld</td><td>2920116</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q H2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Secoueur orbital</td><td>Sanyo</td><td>Mir-S100C</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique 5201</td><td>Heidolph</td><td>523-52019-00</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td>Le PMSF est le seul inhibiteur de protéase utilisé dans cette méthode.</td></tr><tr><td>Bouteilles centrifugeuses en polycarbonate, 70 mL, 38 x 102 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Tubes centrifugeuses en polypropylène, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tubes centrifugeuses en polypropylène, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>AppliChem</td><td>A3582,1000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Lach-Ner</td><td>UN1813</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéiseur de Precellys 24</td><td>Bertin Technologies</td><td>P000669-PR-240-A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de réaction 3810X 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à verrouillage sécurisé 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp ; 0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Tube microcentrifugeuse à bouchon à vis, 2 mL</td><td>VWR</td><td>525-1146</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10 mL</td><td>Nerbe plus</td><td>12-461-9208</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 25 mL</td><td>Nerbe plus</td><td>12-481-9102</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Ultrospec 2000</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>CGS 8162.39</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose (C12H22O11)</td><td>Carl Roth</td><td>9097.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à godet oscillant SW28</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à godet oscillant SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>ARNt provenant d’E. coli MRE 600</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette jaunes, 5-200 & micro ; L</td><td>Thermo Scientific</td><td>94300120</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro essai de réassociation pour mesurer la formation de particules ribosomais 80s à l’aide de sous-unités ribosomales lavées au sel

In Vitro Reassociation Assay to Measure the Formation of 80S Ribosomal Particles Using Salt-washed Ribosomal Subunits

In Vitro Essai de réassociation pour mesurer la formation de particules ribosomais 80S à l’aide de sous-unités ribosomales lavées au sel

Ribosomes are molecular machines that are responsible for protein synthesis in all living cells. All ribosomes consist of two subunits. In eukaryotes, the ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Cet article décrit un protocole pour l'extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d'autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d'ARNm spécifiques en cours d'analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d'intérêt.

Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

La contamination des préparations de ribosomes eucaryotes purifié par les méthodes traditionnelles par les co-purifiant nucléases et protéases une incidence négative sur l'aval des analyses biochimiques et structurelles. Une méthode de purification chromatographique rapide et simple est utilisée pour résoudre ce problème en utilisant des ribosomes levure comme système modèle.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Une technique pour identifier les sites de pause translationnelle sur l'ARNm est décrite. Cette procédure est basée sur l'isolement des polypeptides naissants qui s'accumulent sur les ribosomes lors de la traduction in vitro d'un ARNm cible, suivie par l'analyse de la taille des chaînes naissantes en utilisant une électrophorèse sur gel dénaturant.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

Nous décrivons ici une technique qui est maintenant couramment utilisé pour isoler de manière stable liés ribosome complexes de la chaîne naissante (RNC). Cette technique tire parti de la découverte que de 17 acides aminés de long "séquence d'arrêt" SecM peut arrêter élongation de la traduction dans un procaryote...

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Le suivi des événements de traduction individuels permet des études cinétiques à haute résolution des mécanismes de traduction dépendant du plafond. Ici nous démontrons un essai in vitro d’une seule molécule basé sur des interactions de formation image entre les anticorps fluorescents étiquetés et les peptides naissants épitope-marqués. Cette méthode permet la caractérisation à molécule unique de la cinétique d’initiation et d’élongation peptidique lors de la traduction active in vitro...

Un essai in vitro d’imagerie à molécule unique pour l’analyse de la cinétique de traduction cap-dépendante

Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la...

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Le transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique est une méthode qui suit la dynamique de l’ARNt pendant la synthèse des protéines ribosomiques. En suivant les ribosomes individuels, des populations inhomogènes sont identifiées, ce qui met en lumière les mécanismes. Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements conformationnels biologiques en général afin de révéler les relations dynamique-fonction dans de nombreux autres biosystèmes complexes. Les méthodes à molécule...

Étude de transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique de synthèse de protéines ribosomes

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Ce protocole décrit une méthode pour ubiquitiner Streptococcus pneumoniae en utilisant un lysat cellulaire de mammifère ou un complexe enzymatique d’ubiquitine pur, suivie d’un traitement avec un complexe protéique VCP/p97-UFD1-NPLOC4 purifié afin d’évaluer son activité bactériolytique, permettant l’étude des effecteurs immunitaires dépendants de l’ubiquitine.

In-vitro Reconstitution de l’ubiquitination bactérienne et élimination médiatisée par VCP/p97

Découvrez la réassociation in vitro de sous-unités ribosomiques lavées au sel pour analyser la formation de particules 80S. Cette méthode permet d'étudier les interactions entre sous-unités 40S et 60S et leur rôle dans la synthèse protéique.

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