Name: Imagerie super-résolution de cellules entières via DNA-PAINT sur un disque tournant confocal avec réaffectation optique des photons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Découvrez la microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) pour l'imagerie cellulaire complète en profondeur via DNA-PAINT sur disque tournant confocal avec réaffectation optique des photons.

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<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
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<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
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<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
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<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
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<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn ;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique acide</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>acide 3,4-dihydroxybenzoïque &nbsp ;</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60 et fois ; Objectif Apo NA 1.49</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA colonne de dessalage de spin contenant la résine d’exclusion de taille &nbsp ;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Colonnes de désalage Zeba Spin pour l’étape 2.4</td></tr><tr><td>Accutase - Milieu de décollement des cellules enzymatiques</td><td>Cellule promo</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaga sdAb (1H1) anti-GFP couplé à de l’ADN personnalisé (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>Photonique massive</td><td>Produit personnalisé</td><td>Nanocorps anti-GFP pour Drosophila</td></tr><tr><td>Alpaga sdAb (1H1) anti-GFP couplé à l’ADN</td><td>Photonique massive</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>Nanocorps anti-GFP pour la NUP</td></tr><tr><td>Anti-alpha tubuline (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin</td><td>Photonique massive</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, secondaire sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR&ZETA ; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Tube centrifuge conique 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Tube centrifuge conique 50 mL</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope SDC-OPR</td></tr><tr><td>Dessalage des colonnes de spin avec Sephadex G-25 (résine d’exclusion de taille pour la purification de l’ADN) & nbsp ;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Marque : Cytiva. Colonnes G-25 pour l’étape 2.5</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Médias DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, anhydre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp ; (Dithiothréitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>G5516-500ML&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomédicals</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimide-PEG2-succinimidyl&nbsp ;</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Médias 5A de McCoy</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (acide 2-(N-morpholino)éthanasolifique)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuge 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis microvolume</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-UN-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticules 90 nm - Or</td><td>Cytodiagnostic</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CMOS Orca Fusion-BT</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée phosphate (solution 1x)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16 % de formaldéhyde (va-et-à-vers), sans méthanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium &nbsp ;</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>&nbsp ; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protocatéchuate 3,4-Dioxygénase &nbsp ;</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>P8279-25UN&nbsp ;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Sodium&nbsp ; Hydroxyde</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps TOM20</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de tris</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp ; X-100&nbsp ; &nbsp ;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Préadolescent-20</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge ultrafiltrante, MWCO 100 kDa</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>UFC510024</td><td>Fabricant : Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu ;-Slide 8 puits haut Fond en verre</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu ;-Slide VI 0.5 Fond en verre</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie super-résolution de cellules entières via dna-paint sur un disque tournant confocal avec réaffectation optique des photons

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

Pour démontrer les capacités d’imagerie super-résolution du système SDC-OPR (Figure 1A), sa résolution dans le plan a été évaluée en réalisant des expériences d’imagerie ADN-PAINT (Figure 1B) sur des complexes poreux nucléaires (CPN), qui constituent une structure de référencebiologique 17. La figure 1C montre une image représentative SDC-OPR avec DNA-PAINT de la nucléoporine 96 (Nup96), marquée avec une protéine fluorescente verte monomérique améliorée (mEGFP) et marquée avec des nanocorps anti-GFP conjugués à l’ADN, dans les cellules U2OS. Les panneaux zoomés révèlent la sous-structure NUP, et la Figure 1D montre des protéines Nup96 appariées (indiquées par des flèches) cohérentes avec la symétrie 8 fois attendue des pores nucléaires. À la Figure 1E, la distance euclidienne entre les paires Nup96 a été mesurée en les alignant et en traçant l’histogramme de la section transversale de l’image sommée (n = 16 paires). L’analyse a révélé une séparation pic-pic de (13 ± 2) nm (Figure 1E), en accord avec les résultats des modèles EM ainsi que sur l’imagerieHILO et TIR 23. Chaque ajustement de pic affichait un écart-type de 4 nm, confirmant la haute précision de localisation (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) obtenue avec DNA-PAINT sur SDC-OPR. Notamment, cette précision a été maintenue sur l’ensemble du champ de vision de 53 × 53 μm², ce qui est exceptionnel pour les systèmes à base de confocalité.
Pour démontrer la capacité à l’imagerie multicolore, Nup96, les mitochondries et les microtubules dans les cellules U2OS ont été marqués par ADN pour acquisition à l’aide de l’Exchange-PAINT18. Cette technique utilise des brins d’imageurs d’ADN orthogonaux conjugués à un seul fluorophore, permettant d’exciter toutes les cibles avec la même source laser (Figure 2A). Plutôt que d’acquérir des signaux simultanément, il les sépare à travers des projectiles d’imagerie séquentiels, facilitant une intégration simple dans tout système commercial SDC-OPR. La figure 2B montre Nup96 en bleu marqué avec un nanocorps anti-GFP, les mitochondries en rouge avec un anticorps anti-TOM20 secondaire, et les microtubules en vert avec un anticorps primaire anti-α-tubuline. Notamment, la précision exceptionnelle de localisation sur une seule molécule obtenue pour l’imagerie Nup96 monocolore a été préservée sur toutes les cibles de l’expérience multi-cibles, donnant des valeurs de précision de localisation de 3,9 nm pour le NPC, 4,0 nm pour la α-tubuline et 3,3 nm pour les mitochondries (Figures 2B panneaux 1, 2 et 3).
Pour l’imagerie à grand champ de vision, les microtubules dans les cellules HeLa étaient imagés à l’aide de divers grossissements disponibles sur le système SDC-OPR, combinés à différents réglages de binning de la caméra pour maintenir des tailles de pixels entre 78 nm et 108 nm (Figure 3). La figure 3A montre le cytosquelette microtubulaire de 10 cellules HeLa, avec des couleurs représentant la précision de localisation. À un grossissement de 1×, la précision moyenne de localisation est nettement inférieure à celle des grossissements plus élevés (Figure 3B-D), avec une plus grande variabilité observée. Cela est dû à la réduction de la densité de puissance laser sur le champ de vision plus large, où le profil d’illumination gaussien devient apparent, ce qui entraîne une diminution de la précision vers les bords du champ de vision. Néanmoins, atteindre une précision de localisation moyenne de 9,5 nm sur l’étendu champ de vision de 211 × 211 μm² est impressionnant pour les systèmes à base de champs confocaux et permet une investigation à haute résolution de l’hétérogénéité biologique.
Enfin, la possibilité d’imager des cellules entières est démontrée en acquérant des images ADN-PAINT du réseau de microtubules dans des cellules HeLa fixes d’un volume confocal d’environ ~500 nm d’épaisseur et d’un pas z de 1 μm en utilisant le plus grand grossissement du système (champ de vision de 4×, 53 × 53 μm²). La figure 4A présente les images de reconstruction à une seule molécule pour chaque plan z, ainsi que la précision de localisation correspondante et les valeurs de NeNA. De plus, une visualisation 3D en couleur du réseau de microtubules dans la cellule HeLa est fournie dans la Figure 4C. À mesure que la profondeur augmente, le nombre de photons détectés diminue en raison de la diffusion et des aberrations optiques, ce qui réduit la précision de localisation tant pour les précisions de localisation dérivées de la limite inférieure de Cramér-Rao (CRLB) (Figure 4A, à droite) que pour celles calculées à l’aide de la métrique NeNA. Néanmoins, le haut niveau de collecte de photons possible par le système SDC-OPR permet σSMLM ≤ 10 nm pour une profondeur d’imagerie allant jusqu’à 9 μm avec des distributions étroites. En effet, les structures microtubulaires filamenteuses à double paroi étaient clairement résolues à différentes profondeurs : près de l’interface couverlinge-cellule, en positions axiales intermédiaires, et en haut de la cellule, avec une distance pic à pic entre 30 nm et 40 nm (Figure 4C), cohérente avec les valeursrapportées 24. Ces résultats mettent en lumière la capacité du SDC-OPR à fournir des images haute résolution sur de grands champs de vision et sur toute la hauteur des cellules.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Microscopie de localisation en plan à molécule unique de différents échantillons cellulaires et imagerie multicolore à super-résolution. (A) Schéma du système confocal du disque rotatif avec réassignation optique de photons (SDC-OPR), comprenant un réseau de microlentilles conçu pour maximiser la collecte de photons. (B) Schéma de l’ADN-PAINT : Les brins d’ADN marqués par fluorescence, appelés brins imageurs, s’hybrident transitoirement avec des séquences d’ADN complémentaires (brins d’amarrage) qui sont ancrés à l’anticorps/nanocorps ciblant la protéine d’intérêt. Ces événements de liaison de courte durée génèrent des signaux de fluorescence qui apparaissent sous forme de clignotements stochastiques. (C) Image représentative DNA-PAINT sur le système SDC-OPR en utilisant un grossissement 4× du NPC des cellules U2OS. La capacité haute résolution est démontrée dans l’insert, où les PNJ individuels sont clairement résolus. (D) ADN-PAINT amélioré par SDC-OPR permet de visualiser des NPC uniques, où des flèches blanches mettent en évidence les paires caractéristiques de protéines Nup96 dans l’architecture du pore. (E) Distribution des mesures de distance entre les dimères Nup96 (n=16 paires) au sein d’unités de symétrie NPC uniques. Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Exchange-PAINT pour l’imagerie multicolore à l’aide d’un microscope SDC-OPR. (A) Schéma de l’Exchange-PAINT de trois cibles imagées séquentiellement. Trois cibles protéiques ont été marquées avec des anticorps fonctionnalisés par l’ADN, des fragments Fab ou des nanocorps. Les brins de l’imageur Cy3B ont été imagés séquentiellement par type de brin avec des étapes de lavage entre les projectiles d’imagerie. (B) Imagerie Exchange-PAINT à trois couleurs des cellules U2OS utilisant la microscopie SDC-OPR avec grossissement 4×, montrant les microtubules (rouge ; marqués avec de l’anti-α-tubuline conjuguée à l’ADN), les mitochondries (vertes ; ADN-nanocorps ciblant TOM20), et NPC (bleu ; Nup96 marqué mEGFP avec des nano-nanocorps d’ADN anti-GFP). Barre-échelle : 5 μm. La région zoomée met l’accent sur la résolution améliorée obtenue sur le système SDC-OPR, en se concentrant sur (1) mitochondries, (2) microtubules et (3) NUP. Barres d’échelle = 1 μm. Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Imagerie ADN-PAINT dans de grands champs de vision sur un microscope SDC-OPR. Images ADN-PAINT de microtubules (marquage anti-α-tubuline) acquises à plusieurs grossissements : (A) 1× grossissement et 1 binning (FOV de 211 × 211 μm²), (B) 2,8× et 2 binning (FOV de 76 × 76 μm²), (C) 4× grossissement et 4 binning (FOV de 53 × 53 μm²). La couleur représente la précision de localisation de 0 à 16 nm dans le cas d’un grossissement 1x et de 0 à 4 nm dans les autres. (D) Précision de localisation mesurée à différentes distances (en μm) du centre du champ de vision pour des grossissements de 1× (rouge), 2,8× (jaune) et 4× (vert). Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Imagerie ADN de cellule entière - PAINT. (A) À gauche. Imagerie volumétrique des microtubules dans les cellules HeLa via DNA-PAINT acquise à l’aide de SDC-OPR à un grossissement de 4×, montrant des sections axiales de z = 0 à 9 μm (pas de 1 μm). Chaque plan affiche la position z, la précision de localisation et la métrique NeNA. Barres d’échelle : 5 μm (xy). Exact. Précision de localisation versus profondeur de pénétration pour tous les plans. (B) Rendu 3D du réseau de microtubules sur la même cellule HeLa que dans (A). La couleur représente la profondeur de pénétration de 0 à 9 μm. (C) Images zoomées de petites régions mises en évidence à chaque profondeur de pénétration indiquées par (A). Cette figure a été modifiée à partir de Zaza et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>

Imagerie super-résolution de cellules entières via DNA-PAINT sur un disque tournant confocal avec réaffectation optique des photons

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

Notre protocole utilise DNA-PAINT sur un microscope confocal à disque tournant avec réassignation optique des photons pour surmonter les limites de profondeur. DNA-PAINT atteint désormais un niveau de résolution extrêmement élevé grâce aux multiplexes et aux capacités quantitatives, surpassant d’autres techniques SMLM telles que PALM et STORM. Pour commencer, utilisez un système confocal à disque rotatif équipé d’une unité de réaffectation optique des photons et d’une caméra sCMOS.Démarrez le système 30 minutes avant l’imagerie en allumant le microscope, la caméra et les lasers. Ensuite, démarre l’ordinateur. Attendez que le logiciel NIS-Elements se charge complètement.Sélectionnez maintenant le mode d’imagerie approprié dans NIS-Elements en choisissant SoRa Spinning Disk avant de définir les paramètres d’acquisition. Choisissez l’objectif d’immersion en huile à ouverture numérique Apo 60x 1,49 pour maximiser la détection des événements à molécule unique. Ensuite, sélectionnez le grossissement approprié en fonction de l’objectif, des réglages de l’appareil photo et de l’échantillon.Ajustez la courbure de l’appareil en conséquence pour correspondre au grossissement sélectionné. Fixez le temps d’exposition pour l’acquisition de DNA-PAINT. Maintenant, configurez la longueur d’onde du laser, la puissance du laser et la roue de filtres selon le spectre de colorant de l’imageur.Pour enregistrer la puissance laser après l’objectif, placez un capteur calibré de mesure de puissance laser sur l’étage du microscope près du plan de l’échantillon et notez la puissance mesurée. Ensuite, appliquez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif d’huile Apo à ouverture numérique propre de 60x 1,49. Fixez l’échantillon cellulaire immunocoloré préparé sur la platine du microscope à l’aide d’un adaptateur de platine pour minimiser la dérive.Passez en mode champ clair et concentrez-vous sur le plan de verre en utilisant des nanoparticules comme référence. Ensuite, activez le Perfect Focus System pour maintenir la mise au point pendant l’acquisition. Avec le Perfect Focus System actif, changez temporairement l’excitation vers le canal protéique fluorescent vert pour identifier le plan focal optimal.Utilisez une faible puissance laser pendant cette étape. Définissez le nom de l’expérience et le chemin de sauvegarde. Cochez la case temps pour définir l’intervalle, la durée et le nombre de boucles.Réglez l’intervalle sur Pas de délai et entrez le nombre de boucles correspondant au nombre total d’images. Assurez-vous que la case PFS en bas est sélectionnée. Revenez aux paramètres d’excitation SoRa précédemment définis et appuyez sur Exécuter maintenant.Acquérir 15 000 à 20 000 images pour la première protéine, en utilisant un temps d’intégration de 300 millisecondes. Pour l’analyse d’images, chargez la pile d’images déconvolutées dans le module localisé de Picasso. Sélectionnez Analyser puis Paramètres dans la barre de menu et saisissez les paramètres spécifiques à chaque appareil selon les spécifications du fabricant.Ensuite, réglez la longueur du côté boîte à sept pour optimiser la précision de localisation d’une seule molécule. Choisissez une valeur minimale de gradient net appropriée et activez l’aperçu pour visualiser les localisations détectées. Ajustez le seuil de dégradé pour minimiser les détections de fond.Ensuite, sélectionnez Analyser puis Localiser pour commencer l’identification et l’ajustement des points sur toutes les trames. Chargez le HDF5 résultant dans le module Picasso Render pour visualiser la carte de localisation reconstruite. Choisissez Postprocess puis Undrift par RCC.Entrez une valeur de segmentation initiale commençant à 1 000 pour obtenir un graphique de dérive xy. Répétez avec des valeurs de segmentation plus basses pour améliorer la correction de la dérive. Cliquez sur Fichier et Enregistrer la localisation pour enregistrer le fichier de localisation corrigé par dérive avant de fermer le module de rendu.Ensuite, chargez le fichier corrigé par dérive dans le module Picasso Filter et appliquez des seuils basés sur la précision de localisation, la largeur des fonctions de dispersion ponctuelle, le nombre de photons et d’autres métriques de qualité. Cliquez sur Fichier et Enregistrer la localisation pour enregistrer le fichier de localisation filtré avant de fermer le module filtre. L’imagerie DNA-PAINT de nucléoporine 96 marquée avec une protéine fluorescente verte améliorée par monomérique dans les cellules U2OS a produit un motif clair et super-résolu du complexe poreux nucléaire à travers tout le champ de vision.Des vues zoomées ont révélé des sous-unités appariées de nucléoporine 96, disposées avec la symétrie octuple attendue des pores nucléaires. La mesure de la distance euclidienne entre les paires de nucléoporine alignées 96 a montré une séparation pic à pic de 13 plus ou moins 2 nanomètres. La nucléoporine 96, les mitochondries et les microtubules ont été visualisés simultanément dans les cellules U2OS avec une précision préservée de localisation de la molécule unique sur toutes les cibles.Large champ de vision L’imagerie des microtubules dans les cellules HeLa a démontré que la précision de localisation variait avec le grossissement et la taille du champ, avec une précision réduite observée à un faible grossissement. Des grossissements plus élevés produisaient une précision de localisation améliorée et plus uniforme comparée au grossissement 1x. L’imagerie de cellule entière a été démontrée par l’acquisition par DNA-PAINT du réseau de microtubules sur plusieurs plans axiaux couvrant toute la profondeur cellulaire.La précision de localisation diminuait progressivement avec l’augmentation de la profondeur d’imagerie. Les structures microtubulaires à double paroi ont été résolues à plusieurs positions axiales avec des distances pic à pic comprises entre 30 nanomètres et 40 nanomètres. Notre protocole permet d’obtenir l’imagerie ADN-PAINT des cellules et des tissus profonds sans sacrifier la résolution, en utilisant des optiques simples et disponibles sur le marché.Le DNA-PAINT haute résolution fonctionne principalement sous TIRF ou haute illumination, limitant la profondeur d’image à seulement quelques microns. Nos résultats rendent DNA-PAINT accessible à de nombreux laboratoires, permettant l’imagerie à l’échelle nanométrique dans les cellules et les tissus en profondeur.

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JoVE Journal

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Biologie

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