Name: Développement et standardisation d’une microméthode ex vivo pour la quantification intracellulaire de la vincristine dans les cellules primaires de la LLA par LC-MS/MS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez une méthode LC-MS/MS pour quantifier la vincristine dans les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë pédiatrique. Cette approche optimise le suivi thérapeutique et améliore la compréhension de l'accumulation intracellulaire du médicament.

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<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
<li>Pui, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+progress+through+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).</li>
<li>Gaudichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+extramedullary+relapse+in+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+reconciling+biological+concepts+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues.</a> Blood Rev. 36, 40-56 (2019).</li>
<li>Dhyani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+potential+of+alkaloids%3A+a+key+emphasis+on+colchicine%2C+vinblastine%2C+vincristine%2C+vindesine%2C+vinorelbine+and+vincamine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine.</a> Cancer Cell Int. 22, 206(2022).</li>
<li>Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+intracellular+unbound+drug+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations.</a> Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).</li>
<li>Chien, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+to+determine+intracellular+drug+concentrations+in+cellular+uptake+assays%3A+application+to+metformin+in+organic+cation+transporter+1-transfected+human+embryonic+kidney+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells.</a> Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).</li>
<li>Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+drug+resistance-linked+ABC+transporters+in+cancer+cells+by+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Fiole à bouchon à vis de 2,0 mL</td><td>Débit</td><td>8-2400</td><td>Utilisé avec des inserts en verre à ressort (5 x 29 mm) de la même société (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Fiole à bouchon à vis de 2,0 mL</td><td>Débit</td><td>8-2400</td><td>Utilisé avec des inserts en verre à ressort (5 x 29 mm) de la même société (Cat. 5-29015)</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>AIM V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>Système chromatographique Acquity UPLC H-Class</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>Comtesse 3 FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille en verre</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microtube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>Microtube 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>Fisher Scientific</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>Le logiciel d’acquisition de données</td><td>Waters Co.</td><td>MassLynx</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse triple quadrupôle Xevo TQ-S micro</td><td>Waters Co.</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur ultrasonique</td><td>Quimis</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>Vinblastine 1 mg/mL</td><td>Libbs</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>Vinblastine sulfate</td></tr><tr><td>Vincristine</td><td>Cayman Chemicals</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

développement et standardisation d’une microméthode ex vivo pour la quantification intracellulaire de la vincristine dans les cellules primaires de la lla par lc-ms/ms

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

Les résultats chromatographiques représentatifs obtenus après des tests d’accumulation intracellulaire utilisant des cellules primaires ALL PDX incubées avec VCR et VINB sont présentés à la Figure 1. Les échantillons ont été préparés en utilisant 2,5 × 106 cellules par condition. Dans les conditions chromatographiques décrites, le magnétoscope a été constamment maintenu à 2,85 minutes avec un effet matriciel minimal, et la forme de pic était symétrique et bien résolue. Ces profils...

Développement et standardisation d’une microméthode ex vivo pour la quantification intracellulaire de la vincristine dans les cellules primaires de la LLA par LC-MS/MS

Quantifying intracellular vincristine (VCR) in primary pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells is essential for understanding sample-specific ...

Notre objectif est de mesurer la vincristine intracellulaire dans des échantillons cliniquement pertinents et d’étudier les interactions entre cellules médicamenteuses. Le défi expérimental actuel consiste à optimiser le temps d’incubation à travers le modèle. De plus, l’accommodation médicamenteuse dépendante du modèle limite la robustesse, en particulier dans les échantillons primaires de patients.Pour commencer, décongelez l’échantillon de cellules cryopréservées en faisant doucement tourner le flacon dans un bécher contenant 15 millilitres d’eau distillée à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le contenu soit complètement décongelé. Transférez le contenu du flacon dans un tube conique de 50 millilitres contenant 15 millilitres de PBS 1X stérile à l’aide d’une pipette Pasteur jetable stérile. Placez le tube dans la centrifugeuse réglé à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante.Après centrifugation, il faut éliminer le surnageant en inversant le tube d’un seul mouvement lisse. Maintenant, resuspendez la pellete cellulaire dans 10 millilitres de milieu AIM V à l’aide d’une pipette Pasteur jetable. Comptez les cellules viables à l’aide d’un compteur automatisé et mesurez la taille moyenne des cellules.Calculez le volume nécessaire pour obtenir 2,5 fois 10 à la puissance de six cellules viables en utilisant une proportion simple basée sur la concentration de cellules mesurée. Faites un vortex sur la solution de bouillon de vincristine bien avant utilisation. Ajoutez le milieu AIM V à un microtube de deux millilitres, suivi de 2,5 fois 10 à la puissance de six cellules, puis ajoutez le volume requis de solution de vincristine.Vortex brièvement et faites tourner le tube pendant cinq secondes pour collecter le liquide du bouchon. Ensuite, incubez les micro-tubes ouverts à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Après l’incubation, fermez les couvercles des tubes et centrifugez les échantillons à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante.Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS à température ambiante dans le tube. Après avoir répété les étapes de centrifugation et de lavage, retirez soigneusement tout le surnageant restant à l’aide d’une pipette.resuspendez le pellet dans 100 microlitres de PBS et de vortex jusqu’à ce que le pellet soit complètement resuspendu. Ajoutez maintenant 400 microlitres de méthanol froid contenant 0,1 micromolaire de vinblastine à moins 20 degrés Celsius directement sur l’échantillon tout en évitant le contact avec les parois du tube. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius toute la nuit.Pré-refroidissez la centrifugeuse à quatre degrés Celsius avant de retirer les échantillons du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Immédiatement après avoir retiré les échantillons du congélateur, centrifugez-les à 13 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez 300 microlitres de surnageant dans un microtube de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette.Séchez complètement les échantillons en les plaçant dans un concentrateur sous vide réglé à 45 degrés Celsius pendant une heure et 40 minutes. Après séchage, resuspendez chaque pellet dans 400 microlitres d’eau contenant 0,1 % d’acide formique à l’aide d’une pipette. Faites le vortex doucement jusqu’à ce que la pellete soit complètement dissoute.Maintenant, centrifugez à nouveau les échantillons à 13 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez 300 microlitres du surnageant dans un flacon à vissage de deux millilitres pour une analyse chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Sur l’écran d’accueil du logiciel, ouvrez la liste des échantillons et créez une nouvelle liste en entrant les noms des échantillons, les volumes d’injection, la position des flacons et la méthode à utiliser.Placez un flacon contenant de l’eau ultrapure dans le plateau de l’autoéchantillonneur, et désignez ce flacon comme un vide dans la liste des échantillons. Faites un test blanc entre chaque série d’injections triples pour éviter un report. Sélectionnez les lignes souhaitées dans la liste d’exemples et commencez l’acquisition des données en cliquant sur exécuter et en confirmant avec OK. Après la sortie, sélectionnez un échantillon parmi les résultats et consultez les chromatogrammes en cliquant sur chromatogramme dans la barre de menu du haut.Enfin, sur l’écran d’accueil, cliquez sur les liens cibles. Sélectionnez les fichiers qui viennent de s’exécuter et cliquez sur « traiter ». Sélectionnez la méthode de la vincristine et cliquez sur OK pour générer des tables de sortie.L’analyse chromatographique des cellules xénogreffes primaires d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë, incubées avec une micromolaire vincristine pendant trois heures, a montré de manière cohérente un pic de magnétoscope symétrique et bien résolu à 2,85 minutes, confirmant une rétention appropriée et une interférence matrice minimale. Les courbes d’étalonnage pour la vincristine générées dans le milieu AIM V ont montré une forte linéarité entre des concentrations allant de 0,001 à 10 micromolaires. De même, lorsque deux fois 10 à la puissance de six RS4 ; 11 cellules ont été ajoutées, une réponse linéaire a été observée de 0,01 à une micromolaire.L’analyse du parcours temporel de l’accumulation de vincristine a révélé que RS4 ; 11 cellules ont affiché un plateau dans le ratio vincristine par vinblastine entre deux et trois heures, avec une légère augmentation à quatre et cinq heures, tandis que les cellules primaires PDX ont atteint un pic à deux heures puis ont diminué par la suite, soutenant la sélection de trois heures comme un temps d’incubation équilibré. L’accumulation normalisée de vincristine a varié sur six échantillons de patients atteints de PDX et une corrélation positive a été observée entre les rapports non normalisés de vincristine par vinblastine et le volume cellulaire moyen. L’analyse de fragmentation a confirmé que le pic de base de la vincristine correspondait à l’ion précurseur au rapport de charge maître 413,38, ce qui a généré un ion de quantification à 392,47 et un ion de confirmation à 383,38 sous 40 volts d’énergie cône et 16 volts d’énergie de collision.Notre protocole surmonte les limites des approches indirectes en permettant une mesure intracellulaire directe et sensible de médicaments principalement dans des cellules leucémiques. Notre approche facilite la mesure directe de la vincristine intracellulaire, même si le nombre de votes cellulaires est faible. À l’avenir, nous étudierons si les différences dans l’accumulation intracellulaire de médicaments sont associées à la résistance in vitro et explorerons les mécanismes connexes.

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