Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris
10 avril 2026
Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.
Nous étudions le développement du pancréas endocrinien humain à l’aide d’œillets dérivés des cellules souches afin de comprendre la base génétique du diabète. La transplantation traditionnelle par capsule rénale est très invasive. Le protocole de transplantation intramusculaire offre une alternative plus simple, reproductible et peu invasive.
Pour commencer, ajoutez 0,5 millilitre de solution anti-adhérente à 5 % pour recouvrir le fond d’une plaque de micropuits à 24 puits contenant des micropuits pyramidaux inversés. Centrifugez la plaque à 1 300 g pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, examinez les micropuits au microscope à la recherche de bulles d’air.
Après avoir récentrifugé la plaque, pour éliminer tout air emprisonné, aspirez la solution antiadhérente. Ensuite, lavez chaque puits avec 0,5 millilitres de PBS et répétez l’étape de lavage une fois de plus. Ensuite, lavez les progéniteurs pancréatiques cultivés issus de hPSC avec un millilitre de PBS avec 0,5 millimolaire d’EDTA.
Aspirez le PBS avec 0,5 millimolaire EDTA et recouvrez les puits de trypsine. Puis incubez à 37 degrés Celsius pendant huit à douze minutes. Diluez la trypsine avec deux volumes de DMEM/F12 ou PBS et resuspendez doucement les cellules par pipetage.
Transférez la suspension dans un tube conique et passez immédiatement à l’étape suivante. Centrifugez la suspension à 200 g pendant trois minutes à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant et resuspendez doucement le pellet dans un milieu S4 préchauffé.
Ensuite, aspirez le PBS des antennes micropuits. Ajoutez doucement 1,25 millilitre des cellules en suspension à chaque puits de la plaque micropuits. Centrifugez la plaque à 100 g pendant trois minutes à température ambiante pour répartir uniformément les cellules dans les micropuits.
Transférez soigneusement la plaque à micropuits dans un incubateur humidifié. Pour effectuer des changements de milieu avec des milieux de différenciation, aspirez doucement et distribuez le milieu le long des parois du puits afin d’éviter la turbulence et le déplacement des groupes cellulaires des micropuits. Après avoir transféré la quantité appropriée de grappes générées dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, reliez la seringue à l’ensemble du tube à aiguille et remplissez-le de milieu S7.
Aspirez les grappes directement dans le tube à partir du tube de la microcentrifuge. Pliez le tube en deux et insérez la section pliée dans une pointe de pipette de 200 microlitres. Ensuite, insérez l’aiguille du tube de pointe dans un tube conique de 15 millilitres et fixez les extrémités au bord du tube à l’aide de ruban adhésif.
Centrifugez le tube à 100 g pendant deux minutes à 4 degrés Celsius pour compacter les amas et placez immédiatement le tube sur la glace. Pour transplanter les grappes dans les souris gamma NOD scid anesthésiées, raser la partie médiale de la jambe droite sous le genou et désinfecter avec 70 % d’éthanol. Ensuite, détache le tube de la pointe de la pipette et connecte-le à la seringue.
Coupez le tube près des grappes compactées et fixez-le à l’extrémité émoussée de l’aiguille. Poussez le sérum jusqu’à ce que la première grappe atteigne la pointe de l’aiguille. Ensuite, positionnez la souris allongée, pencez-vous vers la droite et étendez la jambe droite.
Insérez l’aiguille à quatre à cinq millimètres de profondeur dans le compartiment médial de la cuisse droite, entre les muscles adducteur et gracilis. Ensuite, injectez les grappes tout en rétractant l’aiguille d’environ trois millimètres. Faites pivoter la seringue, retirez l’aiguille et laissez la souris récupérer.
Après la récupération de la greffe six semaines après la transplantation et la coupe tissulaire, effectuer une immunocoloration pour permettre des analyses d’imagerie ultérieures. Des suspensions à cellule unique des progéniteurs pancréatiques de stade quatre ont été placées dans des micro-plateaux pour générer des agrégats tridimensionnels contrôlés par la taille. En 24 à 48 heures, des amas sphériques compacts se sont formés.
La microscopie à fluorescence a confirmé la présence de cellules PDX1 et exprimant l’insuline dans les lignées hPSC rapporteures. Après six semaines, le site de greffe a été visualisé macroscopiquement avec des masses semblables à des œillets identifiables dans le muscle. Après l’excision, les explants étaient identifiables au stéréoscopique comme des structures de liaison sphériques pâles.
Une détection robuste des cellules C-peptide positif a été observée chez des animaux transplantés. La coloration à l’insuline a confirmé la présence de cellules humaines de type bêta dans la greffe. Des cellules positives au glucagon et à la somatostatine ont été détectées, indiquant la préservation des populations cellulaires alpha et delta.
Ce protocole facilite les tests fonctionnels in vivo et l’évaluation de la survie et de la maturation des greffes humaines transplantées. La considération la plus importante est d’assurer une différenciation des cellules souches de haute qualité et une manipulation douce des cellules lors de la formation des grappes afin de maximiser la viabilité et d’assurer une bonne survie cellulaire. Ces modèles facilitent l’interrogatoire des mécanismes génétiques sous-jacents au diabète monogénique et au dysfonctionnement des cellules bêta.
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Aperçu
Cet article JoVE présente un protocole détaillé pour la transplantation intramusculaire d'îlots SC pancréatiques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) chez des souris immunodéficientes. La méthode offre une alternative moins invasive par rapport à la transplantation sous la capsule rénale ou sous-cutanée, permettant un accès chirurgical simple et une récupération fiable des greffons. Le protocole permet l'évaluation de la fonction des îlots par sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) in vivo après un défi oral au glucose et facilite l'analyse histologique en aval.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Médecine régénérative
- Thérapie par cellules souches
- Recherche sur le diabète
Contexte
- Les cellules endocrines pancréatiques dérivées de cellules souches pluripotentes humaines offrent des perspectives prometteuses pour la thérapie cellulaire du diabète et la modélisation des maladies.
- Les sites de transplantation actuels, tels que la capsule rénale ou l'espace sous-cutané, présentent des limites techniques ou physiologiques.
- Une implantation in vivo est souvent nécessaire pour étudier la maturation et la fonction des îlots dérivés de cellules souches dans un contexte physiologique.
- Il est nécessaire de disposer de sites de transplantation reproductibles et accessibles permettant la récupération des greffons et l'évaluation de leur fonction.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour la transplantation intramusculaire d'îlots SC dérivés de CSP humaines chez des souris immunodéficientes.
- Permettre l'évaluation de l'attecement, de la survie et de la fonction des îlots dans un site peu invasif.
- Permettre l'évaluation fonctionnelle par GSIS in vivo et par analyse histologique après transplantation.
- Établir un cadre reproductible pour la recherche préclinique sur le diabète utilisant des îlots dérivés de cellules souches.
Méthodes utilisées
- Préparation et compactage d'agrégats d'îlots SC pancréatiques dérivés de CSPH.
- Chirurgie de transplantation intramusculaire chez des souris immunodéficientes.
- Évaluation de la sécrétion in vivo d'insuline stimulée par le glucose (SSIG) après un défi oral au glucose.
- Récupération des greffons et analyse histologique pour l'évaluation post-transplantation.
Résultats principaux
- Engraftement réussi et survie des îlots dérivés de cellules souches pluripotentes humaines au site de transplantation intramusculaire.
- Détection d'une sécrétion d'insuline fonctionnelle en réponse à une charge en glucose par le test GSIS in vivo.
- Récupération fiable des greffons pour analyse histologique confirmant la structure des îlots et l'expression des marqueurs.
- Mise en évidence d'une méthode reproductible et peu invasive pour les études précliniques de transplantation d'îlots.
Conclusions
- La transplantation intramusculaire est un site viable et accessible pour l'attecement d'îlots dérivés de CSP-h chez la souris.
- La procédure permet l'évaluation fonctionnelle d'îlots dérivés de cellules souches par GSIS in vivo.
- La récupération des greffons permet une analyse histologique et moléculaire complète après transplantation.
- Ce protocole fournit un modèle préclinique reproductible pour faire progresser la recherche sur la thérapie cellulaire du diabète.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées de cellules souches pluripotentes humaines fournit un modèle préclinique peu invasif et reproductible pour le développement de thérapies cellulaires du diabète. Cette approche permet l'évaluation fonctionnelle d'îlots dérivés de cellules souches par la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose in vivo et facilite une récupération fiable des greffons pour des analyses ultérieures, palliant ainsi des limitations majeures des sites de transplantation traditionnels. La méthode améliore la fiabilité prédictive de l'évaluation préclinique en offrant un contexte physiologique pour la maturation et la fonction des îlots, tout en améliorant l'accessibilité chirurgicale et en réduisant l'invasivité chez l'animal.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier des hypothèses thérapeutiques en évaluant la maturation fonctionnelle d'îlots dérivés de cellules souches dans un contexte physiologique.
- Valeur opérationnelle : Contribue à la détection biologique des risques grâce à un engraftement fiable et à une sécrétion de l'insuline sensible au glucose chez des souris immunodéficientes.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en fournissant des réponses fonctionnelles reproductibles avant l'optimisation des candidats-médicaments.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des criblages de composés en aval en établissant un engraftement fonctionnel des îlots.
- Valeur opérationnelle : Standardise les procédures de transplantation afin d'assurer la reproductibilité et l'extensibilité dans les études précliniques.
- Valeur stratégique : Améliore la préparation des tests en permettant des sorties fonctionnelles quantitatives par GSIS in vivo pour l'évaluation des effets des composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la pertinence pathologique en modélisant la fonction des îlots humains in vivo, soutenant ainsi l'alignement translationnel des biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Garantit la continuité du stade de découverte à la validation préclinique grâce à une récupération constante des greffons et à une analyse histologique standardisée.
- Valeur stratégique : Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des données fonctionnelles et structurales sur l'attecement et la maturation des îlots.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre à la chaîne de découverte en soutenant la vérification d'hypothèses lors de la phase de découverte précoce, en permettant la standardisation des tests pour le criblage, et en fournissant des lectures fonctionnelles qui éclairent les décisions concernant l'identification de composés candidats et leur progression en phase préclinique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en évaluant la fonction des îlots dans un site de greffe physiologique.
- Essais de criblage : Améliore la préparation des tests grâce à une transplantation standardisée et des mesures reproductibles de sécrétion de l'insuline stimulée par le glucose.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes par le biais de tests de sécrétion immuno-réactive du glucose (GSIS) in vivo afin de comparer la fonction des greffons dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en permettant l'analyse histologique et moléculaire des greffons récupérés pour évaluer leur maturation.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme préclinique réutilisable pour des cycles itératifs de conception et de test dans le développement de thérapies cellulaires souches contre le diabète.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique concernant la fonction et la maturation des îlots dérivés de cellules souches.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'extensibilité des procédures de transplantation entre différents sites de recherche.
- Valeur stratégique : Renforce la pertinence des décisions d'aller/arrêt en fournissant des données fonctionnelles fiables, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée des programmes sur le diabète.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire la priorisation ajustée au risque grâce à une greffe reproductible et une validation fonctionnelle des îlots dérivés de cellules souches.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en différenciation des cellules souches, en techniques de transplantation microchirurgicales et en tests métaboliques in vivo.
- Dépend d'une infrastructure chirurgicale stérile, de systèmes de charge en glucose et de dosages de détection de l'insuline pour obtenir des résultats fonctionnels.
- Exige une standardisation entre équipes impliquant le traitement des cellules, la chirurgie et l'analyse, afin d'assurer des résultats cohérents.
- Implique des adaptations selon les différentes souches de souris immunodéficientes et les délais de maturation des îlots.
- Est limité par la nécessité de surveillance postopératoire et de procédures de prélèvement des greffons, ce qui peut affecter le débit dans les études à grande échelle.
