Procédures pour l’identification des inhibiteurs d’entrée du SARS-CoV-2 en tant qu’antiviraux potentiels à l’aide de pseudovirus à base de MLV

Nos recherches visent à identifier les inhibiteurs qui bloquent l’entrée du SARS-CoV-2 à l’aide de systèmes pseudoviraux. L’étude de l’entrée dans le SARS-CoV-2 nécessite souvent des laboratoires de biosécurité élevée, généralement BSL-3. Ce protocole permet un dépistage antiviral sûr utilisé dans les pseudovirus dans un laboratoire BSL-2 standard.

Pour commencer, placez une plaque de culture tissulaire à six puits dans l’armoire de biosécurité et semez 7,5 fois 10 à la puissance de cinq cellules dérivées de HEK 293 par puits dans deux millilitres de milieu complet. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, confirmez que les cellules ont atteint environ 50 à 60 % de confluence.

Le lendemain, préparez la solution de polyéthylenimine ou PEI en ajoutant cinq microlitres d’un milligramme par millilitre de stock PEI à 50 microlitres de milieu sérique réduit dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Dans un tube microcentrifugeuse séparé de 1,5 millilitre, préparez la solution d’ADN en ajoutant 2,5 microgrammes de plasmide exprimant la GFP à 50 microlitres du même milieu. Mélangez brièvement chaque tube en vortexant, puis faites tourner pendant cinq secondes et incubez à température ambiante.

Pendant la période d’incubation de 10 minutes, retirez soigneusement le milieu de chaque puits de la plaque à six puits sans perturber la monocouche cellulaire et ajoutez un millilitre de milieu de transfection complet sans antibiotiques à chaque puits. Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de la solution d’ADN dans le tube contenant la solution PEI. Mélangez rapidement en pipettant six fois et incubez à température ambiante pendant exactement trois minutes.

Ensuite, ajoutez rapidement le complexe d’ADN PEI goutte en goutte dans le puits correspondant. Maintenant, scellez les bordures de la plaque avec un parafilm et centrifugez à 1000 G pendant 30 minutes à température ambiante sans interruption en utilisant un rotor oscillant et un seau à plaques. Après centrifugation, retirez doucement le parafilm et incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures.

Ensuite, remplacez doucement le milieu de transfection dans chaque puits par deux millilitres de médium DMEM complet préchauffé. Incubez les cellules transfectées à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures, et évaluez l’efficacité de la transfection en évaluant l’expression de la GFP à l’aide de la microscopie à fluorescence. Le HEK 293T de semence a dérivé les cellules en deux plaques à 6 puits comme démontré précédemment.

Désigner une plaque pour la génération de pseudo-virus de pointe SARS-CoV-2 et l’autre pour les pseudo-virus VSVG. Préparez le mélange de transfection et les complexes d’ADN PEI le jour de l’expérience et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, retirez soigneusement le milieu de chaque puits des six plaques sans perturber la monocouche cellulaire.

Ajoutez lentement un millilitre de milieu de transfection complet préchauffé sans antibiotiques à chaque puits, en laissant le milieu couler le long de la paroi du puits. Ajoutez les complexes de transfection préparés aux cellules pour les transfecter comme démontré précédemment. Après 48 heures d’incubation post-transfection, collectez les surnadants de chaque puits dans un tube centrifugeuse conique stérile de 50 millilitres et centrifugez à 290 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.

Collectez le surnageant sans cellules et filtrez-le à travers une unité de filtration stérile en polyvinylidène fluorure à 0,45 micromètre. Préparez des aliquotes d’un millilitre du surnageant filtré et stockez-les à moins 80 degrés Celsius Graine 2,5 fois 10 à la puissance de quatre cellules HSI, une lignée cellulaire hautement sensible au SARS-CoV-2 dans 50 microlitres de DMEM complet par puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits. Préparez et identifiez les puits triple pour chaque condition à tester, y compris les infections pseudo-virales sans étincelle et les contrôles non infectés.

Incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le jour de la transduction, décongelez une aliquote de chaque lot de pseudo-virus sur glace et mélangez doucement par inversion, incluant une aliquote du contrôle sans pointe. Ajoutez les volumes requis de préparation pseudo-virale directement aux puits désignés.

Ajustez le volume de chaque puits à 150 microlitres avec un DMEM complet. Maintenant, scellez la plaque avec un parafilm et centrifugez à 2 500 G pendant 45 minutes à température ambiante sans interruption. Retirez le parafilm et faites couver la plaque pendant 72 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après l’incubation, préparez les réactifs du test de luciférase selon les instructions du fabricant. Dégelez le substrat de luciférase et le tampon de lyse de la luciférase 5X à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Diluez le tampon de lyse 5X du test luciférase à 1X avec de l’eau stérile.

Aspirez soigneusement et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de tampon de lyse 1X à chaque puits. Placez l’assiette sur un shaker et secouez pendant 10 minutes à 150 tours par minute à température ambiante.

Vérifier la lyse cellulaire complète sous un microscope inversé pour confirmer que les cellules sont entièrement lysées et non distinguables. Ensuite, transférez les lysats sur une plaque blanche opaque à 96 puits. Ajoutez 50 microlitres de substrat de luciférase à chaque puits.

Mélangez brièvement en déplaçant doucement la plaque en cercle, placez la plaque dans le luminomètre et mesurez la luminescence. Semez 2,5 fois 10 à la puissance de quatre cellules HSI dans 50 microlitres de DMEM complet par puits dans une plaque de 96 puits comme décrit précédemment. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain, préparez une à trois dilutions en série des composés à tester, tels que l’arbidol dans un DMEM complet contenant 0,5 % de sulfoxyde de diméthyle. À l’aide d’une pipette multi-canaux, aspirez doucement le milieu de chaque puits. Ajouter 50 microlitres de dilution composée correspondante à chaque puits tout en ajoutant un DMEM complet seul aux puits de contrôle de la colonne 12.

Incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Sans retirer les composés, ajoutez directement 50 microlitres de pseudo-virus spike-pic du SARS-CoV-2 à chaque puits dilué dans un milieu complet contenant les mêmes concentrations de composés. Scellez la plaque avec du parfilm.

Centrifugez à 2 500 G pendant 45 minutes à température ambiante sans pause. Après avoir retiré le parfilm, incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Enfin, quantifiez l’infectiosité à l’aide d’un test de luciférase comme démontré précédemment.

La transfection de cellules dérivées de HEK 293T avec une IPE ramifiée a entraîné une efficacité de transfection élevée, donnant environ 70 % de cellules positives à la GFP. 48 heures après la transfection. L’infection des cellules HSI sensibles avec des quantités décroissantes de pseudo-virus à pointe SARS-CoV-2 ou pseudo-virus VSVG a montré une augmentation dépendante de la dose de luminescence avec une augmentation de l’apport de pseudo-virus.

Les pseudo-virus sans pointes et les cellules non infectées ont montré des niveaux de luminescence très faibles. Le composé arbidol a été testé pour sa capacité à inhiber l’entrée des pseudo-virus et a produit une inhibition claire de la réponse à la dose de l’activité luciférase générée par les pseudo-virus spike, avec une inhibition moindre observée chez les pseudo-virus VSVG. Le test a montré un facteur premier Z de 0,54, indiquant une adéquation pour le dépistage.

Le traitement par arbidol à des concentrations débutant à 30 micromolaires n’a pas affecté significativement la viabilité cellulaire comparé aux cellules traitées uniquement avec un véhicule à 0,5 % de sulfoxyde de diméthyle. Ce protocole permettait la production de pseudo-virus à haut titre grâce à des conditions optimisées. Cela permet aux chercheurs de mesurer l’entrée pseudo-virale et d’identifier les composés inhibant l’infection médiée par le pic de SARS-CoV-2.

Une grande efficacité de transfection est essentielle pour générer des pseudo-virus à haut titre et obtenir des signaux d’infection fiables dans les tests en aval. Ce système soutient le dépistage antiviral à haut débit et la dévaluation des inhibiteurs d’entrée contre les variants émergents du SARS-CoV-2, et peut être facilement adapté pour générer des pseudo-virus présentant des protéines d’enveloppe provenant d’autres virus.