Cartographie génomique des modifications des histones et des sites de liaison des facteurs de transcription dans les lignées cellulaires neuroendocrines de petits cancers du poumon grâce à CUT&RUN

L’objectif de notre recherche est donc d’identifier les interactions entre les facteurs de transcription définissant la lignée et les protéines de remodelage de la chromatine dans les différents types de cancer du poumon à petites cellules, dans la régulation des paysages de transcription, et comment ces interactions peuvent contribuer aux processus pathologiques, y compris l’initiation et la progression du cancer. Nous visons à y parvenir en menant des expériences comme CUT&RUN, une technique de séquençage de nouvelle génération capable de profiler ou d’identifier à l’échelle mondiale les emplacements génomiques où ces histones modifiées différenciellement et ces facteurs de transcription liés à l’ADN sont modifiés. En fin de compte, nous espérons identifier de nouvelles voies régulées épigénétiquement qui pourraient être thérapeutiquement exploitables dans le développement de nouveaux traitements pour les patients atteints de cette forme très agressive de cancer du poumon.

Pour commencer, retirez les cellules neuroendocriniennes du cancer du poumon à petites cellules cultivées de l’incubateur à 37 degrés Celsius et examinez-les au microscope pour en assurer la qualité. Ensuite, transférez la suspension de la cellule dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez le tube à 1 200 g pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirez le milieu du tube conique en utilisant le vide dans la hotte et rinçez la granule cellulaire obtenue avec 20 millilitres de PBS.

Centrifugez à nouveau le tube à 1 200 g pendant cinq minutes, puis aspirez le PBS. Ajoutez l’Accutase selon la taille du granule et faites couver pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius pour digérer le granule cellulaire. Ensuite, interrompez la digestion en ajoutant cinq millilitres de PBS avec 10 % de FBS et en mélangeant pour obtenir une suspension à cellule unique.

Après centrifugation des cellules à nouveau, comme démontré précédemment, resuspendez la pellete dans cinq millilitres de PBS. Comptez les cellules de départ et confirmez leur viabilité et leur intégrité à l’aide du compteur automatique de cellules. Calculez le nombre total de cellules nécessaires et ajoutez 20 % de surplus pour compenser les erreurs de pipetage.

Transférez le nombre total calculé de cellules dans des tubes de 1,5 millilitre et centrifugez les tubes à 600 g pendant trois minutes à température ambiante. Résuspendre les cellules dans le tampon de lavage à une densité de cinq fois 10 à la puissance de cinq cellules par réaction, pour un total de six réactions. Utilisez 100 microlitres de tampon par réaction et pipettez doucement mais minutieusement pour assurer une suspension uniforme.

Centrifugez à nouveau les cellules, retirez le surnageant, et répétez le lavage. Aliquote 100 microlitres des cellules lavées dans chaque tube d’un ensemble de huit bandes contenant 10 microlitres de billes de concanavaline A activées. Faites doucement une pipette pour mélanger le contenu.

Incubez la boue de cellules de billes pendant 10 minutes à température ambiante pour permettre la liaison cellulaire aux billes, puis faites rapidement tourner les tubes dans une mini-centrifugeuse pour collecter la boue sans laisser les billes se déposer. Placez les tubes sur un support à aimants de 0,2 millilitre à tubes. Laissez la pâte s’éclaircir et pipetez pour retirer le surnageant.

Ensuite, retirez les tubes de l’aimant. Ajoutez immédiatement 50 microlitres de tampon anticorps glacés à chaque réaction et pipetez doucement pour resuspendre les billes. Étiquetez correctement les huit tubes à bande.

Ajoutez 0,5 microgramme chacun d’anticorps H3K4me3, H3K4me1 et immunoglobuline G et 0,6 microgramme d’anticorps polyclonal E2F7 provenant de différentes sources à chaque tube de réaction. Pipettez doucement pour mélanger soigneusement le contenu de chaque tube de réaction et incubez-les toute la nuit sur un nutator à quatre degrés Celsius, avec les bouchons des tubes surélevés. Retirez les huit tubes en bande du nutator et effectuez une rotation rapide pour recueillir le liquide au fond de chaque tube.

Maintenant, placez les tubes sur le support à aimants jusqu’à ce que la boue se dissipe. Ensuite, pipette soigneusement pour retirer et éliminer le surnageant. En gardant les tubes sur le support magnétique, lavez chaque tube deux fois avec 200 microlitres de tampon de perméabilisation à cellules froides et utilisez une pipette à plusieurs canaux pour retirer le surnageant après chaque lavage.

Ensuite, retirez les tubes du support magnétique. Ajoutez immédiatement 50 microlitres de tampon perméable aux cellules froides à chaque réaction et pipetez doucement pour resuspendre les cellules et les biles. Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres de protéine AG-micrococque nucléase à chaque réaction et mélangez bien en pipettant doucement.

Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, effectuez un rapide tour des tubes. Replacez-les sur le support à aimants jusqu’à ce que la boue se dissipe, puis retirez le surnageant. Après avoir lavé les billes deux fois avec un tampon de perméabilisation à cellules froides, resuspendez-les doucement dans 50 microlitres du tampon perméable des cellules.

Tout en gardant les tubes sur la glace, ajoutez un microlitre de 100 millimolaires chlorure de calcium à chaque réaction dans la bande de huit tubes de l’étape précédente. Pipetez doucement pour resuspendre complètement les billes et favoriser une digestion efficace. Incubez les tubes sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant deux heures, en gardant les bouchons des tubes surélevés tout au long de l’incubation.

Maintenant, dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, préparez le mélange de tampon d’arrêt en combinant 33 microlitres de tampon d’arrêt avec un microlitre de pic d’Escherichia coli dans l’ADN à 0,5 nanogramme par réaction. Mélangez doucement la solution en vortex. À la fin de l’incubation de deux heures, ajoutez 33 microlitres du mélange tampon d’arrêt préparé dans chaque tube de réaction et mélangez soigneusement.

Incubez les tubes de réaction dans un thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après un tour rapide, placez les tubes sur un support à aimants jusqu’à ce que la solution devienne claire. Transférez soigneusement environ 85 microlitres du surnageant contenant l’ADN de libération CUT&RUN dans des tubes frais de 1,5 millilitre.

Purifiez l’ADN récupéré, évaluez sa quantité et effectuez la distribution de la taille des fragments pour le contrôle de la qualité. Ensuite, procéder à la préparation des bibliothèques CUT&RUN, à la quantification, au pooling indexé des bibliothèques et au séquençage de nouvelle génération par les extrémités en paires. Les lignées cellulaires hautes homologues de l’écus Achaete-1, DMS79 et H146, et les lignées cellulaires élevées du facteur de différenciation neurogénique 1, H82 se sont développées comme agrégats non adhérents ou sphéroïdes compacts en suspension, tandis que H446 présentait une morphologie mixte, avec environ 80 % de cellules inhérentes et 20 % en suspension.

L’analyse des fragments d’ADN CUT&RUN a révélé que la marque d’histone amplificatrice H3K4me1 a donné les plus grandes quantités d’ADN sur toutes les lignées cellulaires, suivie de H3K4me3, avec E2F7 et IgG les plus faibles. Pour l’ADN CUT&RUN extrait, la distribution de la taille des fragments pour H3K4me1 et H3K4me3 a montré des pics clairs pour les mono-nucléosomes et di-nucléosomes, ainsi que pour l’ADN génomique. En revanche, aucun pic distinct n’a été détecté pour E2F7 ou le contrôle IgG.

Malgré un faible apport ADN, des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération ont été construites avec succès pour toutes les cibles CUT&RUN, y compris E2F7 et IgG. L’analyse de la carte thermique dans les cellules sauvages de type DMS79 et H146 hétérozygotes mutantes a montré que les signaux H3K4me3 et E2F7 étaient enrichis près des sites de début de transcription, tandis que les signaux H3K4me1 étaient plus largement distribués. La visualisation par navigateur génomique dans une région de chromatine sélectionnée aléatoirement a montré des pics distincts pour H3K4me3, H3K4me1 et E2F7, tandis que IgG n’a montré aucun enrichissement.

Ainsi, traditionnellement, les scientifiques et chercheurs ont utilisé l’immunoprécipitation par la chromatine suivie du séquençage ou le ChIP-seq pour répondre à des questions comme celles que nous posons. Cependant, ChIP-seq nécessite une quantité assez élevée de matériaux d’entrée, ce qui n’est pas toujours réalisable selon le modèle utilisé. CUT&RUN, en revanche, nécessite beaucoup moins de matériel d’entrée, aussi bas que 50 000 cellules, et nécessite moins de lectures de séquençage à haut débit, ce qui signifie que c’est moins coûteux et produit beaucoup moins de fonds en ce qui concerne la génération de données.

CUT&RUN est une technique qui peut être appliquée non seulement aux cellules en culture 2D, mais aussi à d’autres modèles précliniques, tels que les organoïdes dérivés des patients et les xénogreffes. Il peut également être utilisé pour profiler le paysage de la chromatine dans les tissus, y compris les tissus normaux et malades. C’est donc une technologie ou une technique incroyablement utile pour les chercheurs en cancer, mais cela peut aussi être très utile pour les chercheurs non cancérologiques qui se concentrent sur l’étude de différentes maladies humaines.

Ce protocole permet de cartographier les modifications des histones et les profils durables des diverses protéines in situ dans le génome cellulaire. Fournir des PTM d’histones et la liaison de la TF entre les sous-types de SCLC peut révéler des gènes ciblables spécifiques au sous-type et des éléments régulateurs, tels que les amplificateurs et les super-enhancers.