Localisé ARNi et l'expression des gènes extra-utérine dans la sangsue médicinale

La sangsue médicinale constitue un système modèle utile pour les études neurobiologiques en raison de sa simplicité, de son accessibilité et de la possibilité d'identifier des neurones statiques à l'aide de nombreux outils expérimentaux, depuis l'embryogenèse précoce jusqu'à l'âge avancé. Une application particulièrement intéressante de l'embryon de sangsue réside dans les études d'imagerie en temps réel des prolongements neuronaux chez l'animal vivant intact, après des modifications très précises de l'expression génique dans le neurone ÉTUDIÉ ou ses cibles. Dans cette vidéo, nous démontrons une technologie innovante permettant une livraison rapide, précise et hautement localisée de réactifs dans les couches internes d'embryons vivants de sangsue, au moyen d'un pistolet pneumatique à capillaires mis au point en collaboration entre le laboratoire d'Alex Grossman et notre laboratoire.

Bien que cette technique puisse être appliquée à la livraison d'ADN ou d'ARN double brin, ou de toute autre molécule pouvant être chargée sur des particules microscopiques d'or, nous allons l'utiliser à la fois pour la perte et l'insertion de l'expression de la molécule de guidage axonal Rin. Bonjour, je viens du laboratoire d'Eduardo Ano, à la Division des sciences biologiques de l'Université de Californie à San Diego. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de réduire ou d'insérer l'expression de la molécule de guidage axonal appelée networking, qui est naturellement exprimée dans la paroi ventrale du corps, mais pas dans le domaine dorsal de tous les segments corporels du lech.

Nous introduirons des molécules d'ARN double brin ou d'ADN plasmidique dans la paroi corporelle et les ganglions des segments sélectionnés aux premiers stades du développement. L'administration globale à l'aide d'un pistolet pneumatique à capillaires est particulièrement importante car elle permet de perturber les profils d'expression génique dans des zones sélectionnées du sous-segment, les segments non traités servant de contrôle interne. En outre, cette méthode peut être utilisée pour atteindre les couches internes de cellules aux premiers stades du développement sans endommager les tissus et sans ouvrir l'échantillon.

Enfin, l'administration globale présente l'avantage de pouvoir cibler un nombre limité de cellules dans un emplacement sélectionné, une approche intermédiaire entre l'extinction ciblée d'une seule cellule par microinjection et l'extinction systémique par des méthodes génétiques. Commençons donc. Le LE médicinal est depuis longtemps utilisé pour étudier les propriétés des cellules nerveuses et des circuits neurologiques liés au comportement, en raison de la simplicité de son système nerveux central, composé d'environ 200 paires bilatérales de neurones et d'un petit ensemble de cellules gliales géantes.

Chaque ganglion segmentaire des 21 segments corporels, chaque neurone de la sangsue peut être identifié de façon répétée et étudié d'un spécimen à l'autre, depuis l'embryon précoce jusqu'à l'adulte âgé. Depuis l'époque des pharaons, la sangsue est utilisée à des fins de saignée, et son utilisation continue en médecine la rend facilement disponible auprès de fournisseurs commerciaux d'animaux. Toutefois, puisque nous étudions le développement du système nerveux, nous entretenons dans notre laboratoire une colonie reproductrice de plusieurs centaines de sangsues, ce qui nous fournit un approvisionnement régulier en embryons pour nos expériences.

Les sangsues sont hermaphrodites. Elles possèdent des structures mâles et femelles et se fécondent croisément. Par conséquent, tous les spécimens peuvent pondre des œufs.

Ils effectuent cela dans une structure appelée cocon, qu'ils fabriquent eux-mêmes à l’aide d’un ensemble de glandes spéciales produisant des polymères très intéressants dans une région du corps nommée le clytelle. Lorsqu’il est prêt à pondre, un invertébré se creuse un abri dans la mousse que nous fournissons dans les réservoirs, puis commence à former ce cocon de forme ovoïde autour de son corps. Une fois suffisamment de matériau extrudé et que les molécules ont commencé à polymériser, l’animal dépose à l’intérieur du cocon ses œufs ainsi qu’un vitellus nutritif, puis se retire en se tortillant. À l’aide d’un scalpel, nous pouvons extraire les embryons en découpant une fenêtre à l’extrémité d’un cocon.

Généralement, chaque cocon contient de 10 à 20 embryons à partir d'environ le sixième jour suivant le début de leur différenciation. Les embryons peuvent être extraits du cocon et élevés dans de l'eau d'étang. Ce sont ces stades que nous utilisons habituellement pour commencer nos études expérimentales sur le développement neuronal.

La première étape importante de cette procédure consiste à préparer les particules revêtues. Dans cette démonstration, nous montrerons comment délivrer des particules d'or revêtues de molécules d'ARN double brin homologues à l'ARN de la molécule d'orientation axonale rin dans des embryons de lech. Les cellules cibles sont les cellules musculaires longitudinales ventrales de la paroi corporelle, qui expriment et libèrent connu Rin dès les premiers stades de l'agénésie.

Notre objectif est d'inhiber l'expression naturelle dans un seul segment corporel le plus tôt possible au cours du développement, et d'observer comment cela affecte les catégorisations des neurones sensibles à ce facteur de développement important. Pour cette étape, un bain sonique, un vortex, une centrifugeuse de laboratoire et un seau à glace sont nécessaires. Il faut également de l'isopropanol à 100 %, qui doit être mis sur glace avant utilisation.

Commencez avec 100 microlitres de tampon de liaison contenant 50 milligrammes de particules vault par millilitre. Ces particules sont conçues pour l'ARNi et produites par la société chell. Ensuite, diluez la solution de particules en ajoutant 100 microlitres de tampon de liaison, vortexez brièvement et soniquez pendant une à deux minutes afin de séparer les particules qui auraient pu s'agglomérer.

Après deux minutes de mise en suspension, ajoutez cinq à 10 microgrammes d'ARN double brin aux particules, vortexez et laissez-les à température ambiante pendant deux minutes. Une fois ces deux minutes écoulées, centrifugez les complexes de particules d'ARN double brin à un minimum de 2 500 tr/min dans la microcentrifugeuse pendant environ 15 secondes.

Pour obtenir le culot, retirez le surnageant et ajoutez 750 microlitres d'isopropanol à l'aide d'une pipette, en perturbant le moins possible le culot. Faites une courte centrifugation en microcentrifugeuse, puis retirez le surnageant après la centrifugation. Ensuite, resuspendez les particules d'or dans 100 % d'isopropanol froid par sonication. Appliquez brièvement deux à trois impulsions au sonicateur afin de séparer les particules.

Verser sur une lame de verre et laisser le solvant s'évaporer complètement. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les particules sont recouvertes juste avant leur administration au tissu, ce que nous allons vous montrer comment faire à l'étape suivante. Avant d'effectuer la transfection *in situ*, examinons la configuration expérimentale et la manière de la préparer.

Le pistolet capillaire pneumatique est fixé sur un micromanipulateur afin de délivrer précisément des particules dans les embryons. La surface de l'embryon est observée à l'aide d'un microscope vidéo. Un laser à semi-conducteur génère un faisceau lumineux dirigé à travers la capillaire interne du pistolet et utilisé pour viser le tissu cible.

Des lignes séparées de tubes Titan reliées aux trois entrées de la tête du pistolet fournissent du gaz hélium sous pression à partir d'une seule source. Une ligne est toujours ouverte, créant un flux continu de gaz hélium à travers le pistolet. Deux autres lignes sont normalement fermées par une vanne électromagnétique et contiennent des particules d'or recouvertes de deux revêtements différents, qui ont été chargées dans les tubes.

Sous forme de poudre sèche. La capillarité externe du pistolet est reliée à un système sous vide avec une pression manométrique de -12,5 psi. La pression amont de hi est ajustée entre 10 et 15 psi afin d'obtenir la profondeur de pénétration des particules souhaitée.

La pression d'entrée d'hélium peut fortement influencer la profondeur de pénétration des particules, tout comme la distance entre l'embryon et le pistolet. Le diamètre de la buse, qui varie selon les différents pistolets à gènes, doit être choisi en fonction de la zone cible. Maintenant que nous avons présenté notre dispositif expérimental, chargeons notre pistolet Jing et tirons sur des embryons de lech.

Avant de charger le tube Titan, il est essentiel que les particules d'or recouvertes soient parfaitement sèches. Les particules d'or recouvertes sont d'abord grattées des lames de verre à l’aide d’une lame couvre-objet ou d’un rasoir, puis sont prêtes à être introduites dans le morceau de papier buvard plié. Le tube doit être courbé en forme de U près du raccord afin que les particules ne se répandent pas sur toute la longueur du tube lors du chargement, mais soient concentrées près du raccord.

Prendre les particules avec une petite spatule ou un morceau de papier de pesée en forme de V et charger le tube. Tapoter doucement le tube avec le doigt pendant l'étape de chargement afin de répartir uniformément les particules. Une fois le tube chargé, nous pouvons passer à l'administration de l'ARN double brin à l'aide du pistolet Jing, mais pas avant d'avoir préparé nos sangsues.

Ici, vous pouvez voir nos embryons de sangsue, qui ont environ 10 jours. Ils se trouvent désormais dans un milieu stérile dans lequel ils seront conservés avant et après l'administration d'ARN double brin. La première étape de la préparation des embryons expérimentaux pour l'administration d'ARN double brin consiste à ajouter une solution d'éthanol à 8 % dans un milieu stérile dans une pièce plate en silicone souple présentant une rainure en forme de V.

Un embryon est ajouté et placé avec la face ventrale vers le haut immédiatement avant de projeter les particules. Le milieu dans la chambre est abaissé juste en dessous de la surface supérieure de l'embryon, et un morceau de papier absorbant, comportant une petite ouverture découpée au centre, est placé dessus afin de stabiliser l'embryon et d'empêcher sa surface de se dessécher, tout en exposant uniquement la zone qui sera ciblée au stade embryonnaire que nous utilisons aujourd'hui. Au stade E 10, les cellules musculaires longitudinales se situent à environ 10 à 20 micromètres de la surface externe, en profondeur par rapport à l'épiderme, au derme et aux muscles circulaires.

Contrairement aux cellules musculaires, les ganglions centraux situés sur le côté ventral des embryons aux stades embryonnaires avec lesquels nous travaillons, de E7 à E12, se trouvent à environ 50 micromètres en profondeur par rapport à la surface ventrale du corps. Nous allons régler la pression d'hélium de manière à cibler les muscles longitudinaux, qui se situent à une profondeur plus superficielle que les ganglions. Nous sommes maintenant prêts à bombarder les muscles longitudinaux avec des particules d'or.

Une charge de particules d'or pesant environ un demi-milligramme peut généralement être utilisée pour jusqu'à 10 tirs, un tir unique délivrant habituellement quelques centaines de particules. Un tir est produit en ouvrant brièvement l'une des valves pendant 0,3 seconde, provoquant l'injection d'un bolus de particules provenant de la tubulure correspondante dans l'âme du canon. Pour couvrir la zone de tissu d'intérêt, plusieurs tirs sont souvent nécessaires.

Le tube est légèrement tapoté entre chaque tir afin de déloger certaines particules et faciliter leur injection dans le flux continu d'hélium à l'intérieur de l'âme du canon. Si l'on souhaite administrer un second réactif dans le même essai, on peut charger des particules alternatives dans un second tube immédiatement après l'administration des particules d'or. Les embryons sont replacés dans de l'eau de mare artificielle, de préférence un embryon par boîte, pendant un à trois jours, jusqu'à ce que l'ARNi ou l'expression ectopique soit jugée suffisante.

Pendant cette période, les embryons sont conservés dans une chambre sombre à température ambiante. Voici un aperçu d’un test d’hybridation ceto pour le knockdown de l’ARNm narine, Mr.NA. Vous pouvez observer que, dans l’embryon traité, quelques cellules musculaires n’expriment pas terrin.

Ces muscles contiennent des particules. On peut observer que lorsque les particules étaient recouvertes d'ARN double brin terrin, elles provoquent une inhibition clairement visible de l'expression de narin, inhibition qui ne se produit que dans les cellules contenant des particules, généralement une à deux particules par cellule. Lorsque vous codez les particules avec un plasmide codant pour la GFP, vous obtenez une fluorescence dans les cellules neuronales lorsque celles-ci s'arrêtent dans leurs noyaux avec le pistolet à capillaires pneumatique que nous utilisons.

Dans cette démonstration, nous avons pu délivrer les deux types de particules dans les cellules d'un petit volume localisé d'embryon vivant sans causer de dommages détectables aux cellules de la zone ciblée. Nous vous avons également montré comment le dispositif nomade à capillaire permet une technique de délivrance globale et confère une nouvelle capacité à activer ou inhiber des gènes dans une région microscopique d'un tissu confiné en trois dimensions et ciblé avec une haute précision, sans dommages détectables pour le tissu. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.