Analyse de l’ADN microbien sur le terrain à l’aide d’un kit d’extraction biologique et d’une unité qPCR de terrain

Le champ de notre recherche consiste vraiment à réaliser des analyses moléculaires que nous pouvons utiliser pour caractériser les microbes impliqués dans la remédiation, l’exploitation minière, la prévention de la corrosion, et cela nous aide vraiment à répondre aux questions sur la durabilité. Cette recherche répond à plusieurs lacunes en matière de recherche et d’accessibilité grâce à l’utilisation de flux de travail biologiques moléculaires fiables et portables sur le terrain, simples à utiliser. Débouchez les deux extrémités du filtre et connectez une seringue de trois millilitres remplie d’air au filtre en utilisant la connexion de verrouillage du luer.

Poussez l’air à travers pour expulser l’eau résiduelle. Déconnectez la seringue et aspirez plus d’air avant de répéter. Ensuite, rebouchez le bouchon rouge de la sortie.

Inversez la solution sur une seringue pour mélanger. Retirez le bouchon de la seringue verrouillante Luer et reliez la seringue Solution A à l’entrée du filtre encapsulé de 0,2 micromètre via la pointe de verrouillage Luer. Appuyez sur le ventouse pour ajouter lentement la solution A. Ensuite, secouez vigoureusement le filtre fermé pendant cinq minutes.

Maintenant, inversez la seringue Solution B plusieurs fois pour mélanger. Retirez le bouchon de verrouillage Luer et connectez la seringue à l’entrée du filtre encapsulée via la pointe de verrouillage Luer. Après avoir rebouché le bouchon du filtre d’entrée, agitez vigoureusement le filtre fermé pendant cinq minutes.

Retirez le bouchon d’entrée et inversez le filtre. Utilisez une seringue de trois millilitres attachée à l’unité de filtration encapsulée pour pousser un millilitre d’air dans le filtre. Ensuite, tirez sur le plongeur pour retirer tout le lysat.

Transférez le lysat dans un tube à billes de cinq millilitres. Après l’avoir scellé avec du parafilm, secouez vigoureusement le tube à billes pendant cinq minutes avant de le placer à la verticale. Placez la cartouche de préparation de l’échantillon sur une surface plane et fixez une colonne verrouillable Luer à une seringue d’un millilitre.

Utilisez la pointe pointue de la colonne pour percer deux trous dans la première section de la cartouche de préparation de l’échantillon. Pipeter un millilitre de lysat du tube à billes dans le trou fraîchement percé de la première section de la cartouche. Insérez la colonne de seringues dans la section rouge de la cartouche.

Ensuite, tirez complètement le liquide dans la seringue puis poussez-le 10 fois. Maintenant, placez la pointe pointue de la colonne de seringue au-dessus de la section rouge-orangée et percez deux trous à travers la barrière en aluminium. Avec la ventouse, tirez tout le volume de fluide de la seringue jusqu’à la seringue et pompez complètement le liquide vers l’extérieur.

De même, utilisez la colonne de seringue pour percer et pomper les sections orange, jaune, bleue, sèche à l’air libre et verte, en tirant et en poussant le plongeur selon le nombre de fois indiquée sur la section. Ensuite, utilisez la seringue d’un millilitre et la colonne de préparation de l’échantillon pour transférer toute la solution de la section verte dans un microtube d’un millilitre bien étiqueté. Placez jusqu’à trois échantillons d’ADN extraits sur le champ dans le bac d’échantillons pur, en quantités d’un instrument qPCR basé sur le terrain, en garantissant un échantillon par section désignée.

Placez les bandes d’essai pour chaque échantillon dans les fentes correspondantes A, B ou C sur le plateau, en alignant le premier puits de chaque bande avec le premier emplacement du plateau. Déverrouillez le téléphone et ouvrez l’application nommée d’après l’instrument qPCR déposé. Lorsque l’application s’ouvre, appuyez sur le bouton Démarrer Exécution.

À l’écran suivant, appuyez sur le bouton Générer des IDs. Saisissez les informations de l’exemple en tapant sous Sample ID et en tapant le nom de l’échantillon. Tapez les unités d’échantillon et sélectionnez l’unité appropriée, puis appuyez sous la quantité d’échantillon et entrez le volume utilisé lors de l’extraction.

Après avoir saisi les informations de tous les échantillons, appuyez sur le bouton Continuer. À l’écran suivant, appuyez sur l’icône de dossier puis sur Enregistrer dans le dossier actuel. Tapez un nom de course et appuyez sur Confirmer.

Allumez l’instrument en maintenant le bouton d’alimentation jusqu’à ce que tous les phares avant s’allument. Appuyez sur Confirmer dans la demande pour continuer. Appuyez sur connecter via le sans-fil intégré à courte portée dans l’application.

Appuyez sur le bouton sans fil intégré à courte portée sur l’instrument jusqu’à ce que la lumière bleue clignote. Ensuite, appuyez sur Confirmer et sélectionnez le nom de l’instrument pour vous connecter. Retirez les bouchons des tubes de bande de sortie pour le premier échantillon.

Ajoutez 18 microlitres d’eau stérile dans chaque puits et pipetez doucement pour dissoudre le pellet. Ajoutez deux microlitres d’échantillon à chaque puits et scellez les tubes avec des capsules de bandes de test en caoutchouc, en assurant une bonne orientation. Appuyez sur Confirmer dans la demande une fois que toutes les bandes sont prêtes.

Retirez chaque bande de test. Vérifiez s’il y a des bulles au fond des puits, puis faites doucement onduler la bande jusqu’à ce que les bulles montent. Appuyez sur Confirmer pour continuer.

Ouvrez le couvercle de l’instrument et placez les bandes de test dans l’instrument dans l’ordre et l’orientation corrects. Fermez le couvercle jusqu’à ce qu’il se verrouille, puis appuyez sur Confirmer. Appuyez sur le bouton Start Run dans l’application pour lancer la course.

Lorsque la course se termine, appuyez sur Résultats par e-mail. Une fois connecté à l’internet sans fil, appuyez sur Envoyer à nouveau pour transmettre les résultats. Nettoyez soigneusement le plateau entre les passages pour éviter toute contamination.

La réussite de l’isolement de l’ADN à l’aide du kit de terrain d’extraction biologique a été confirmée par des résultats qPCR cohérents comparés à une méthode validée en laboratoire. La dilution en culture standard des Dehalococcoides analysée à l’aide de l’unité qPCR basée sur le champ a montré une faible déviation sur 10 répétitions à 21 degrés Celsius et 30 degrés Celsius. Les essais de précision des instruments de terrain ont montré un écart type relatif inférieur à 5 % sur toutes les sorties.

Nos résultats font vraiment progresser le domaine en permettant la surveillance environnementale dans ces lieux isolés, favorisant l’accessibilité, l’engagement communautaire, et rendent des recherches scientifiques très influentes. Nos résultats ont ouvert la voie à la compréhension de la façon dont les échantillons changent lors de l’expédition par rapport à l’extraction et à l’analyse immédiates. Les recherches futures se concentreront sur la définition des limites de ces méthodes pour des échantillons extrêmes comme la saumure, ainsi que pour les conditions météorologiques extrêmes.