Méthodes pour la quantification in situ de la morphologie mitochondriale dans les cellules musculaires et terminales de Schwann de souris

Nos recherches étudient pour la première fois la morphologie mitochondriale des cellules terminales de Schwann à la jonction neuromusculaire. Notre approche permet de quantifier la morphologie mitochondriale dans des tissus autrement difficiles à obtenir, tels que les lits capillaires et lymphatiques. Pour commencer, obtenez un type sauvage et une souris D2-mdx.

Après confirmation de la profondeur anesthésique par réflexe de pincement de l’orteil, insérez l’aiguille au niveau du tendon distal vers le genou droit. Injectez 50 microlitres de coloration mitochondriale fluorescente à deux micromolaires rouge lointain sur l’intérieur du tibial, ou muscle TA, tout en retirant l’aiguille le long du trajet d’injection, puis incubez le colorant in vivo pendant une heure. Tout en maintenant l’animal sous anesthésie, utilisez des ciseaux et des pinces pour disséquer et isoler le muscle TA avant l’euthanasie.

Placez le muscle TA isolé dans du paraformoldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, sous un microscope stéréoscopique, séparez doucement les fibres en les taquinant. Ajoutez une coloration à base d’acide nucléique permanente cellulaire au paraformodéhyde à 4 % pour obtenir une concentration finale de cinq à dix microgrammes par millilitre pour le marquage nucléaire.

Ensuite, lavez le muscle TA trois fois en PBS pendant cinq minutes chacune pour éliminer l’excès de colorant. Déshydratez le muscle séquentiellement à 50%75 % et 100 % d’éthanol pendant cinq minutes chacun. Ensuite, incubez l’échantillon séquentiellement dans des solutions dégageant les tissus un et deux pendant 30 minutes chacune, en veillant à ce qu’ils soient complètement immergés.

Posez le muscle sur une toile de protection. Utilisez un bloc de verre de 2,5 par 2 par 1 centimètre pesant 7,8 grammes pour l’aplatir doucement. Procurez-vous une souris S100 bêta.

Après avoir confirmé la profondeur anesthésiante par le réflexe pincé des orteils, réalisez une petite incision cutanée au-dessus du muscle du grand fessier, ou muscle GM. Injectez 75 microlitres de coloration mitochondriale fluorescente rouge lointain à deux micromolaires sous le muscle MG. Fermez la plaie et laissez le colorant incuber pendant 45 minutes pour marquer sélectivement les cellules terminales de Schwann.

Tout en maintenant l’animal sous anesthésie, disséquez le muscle MG dans les 10 minutes, puis placez-le immédiatement dans une solution saline stérile refroidie à 0,9 %. Uniquement si vous utilisez des souris D2-mdx, ajoutez un colorant fluorescent des récepteurs de l’acétylcholine à une dilution de un à 500 dans le bain de microdissection, puis incubez le tissu pendant 30 minutes. Coupez l’excès de graisse et de tissu conjonctif, puis transférez le muscle GM sur un coverslip avec le côté ventral orienté vers le bas pour la microscopie inversée.

Ajoutez deux microlitres de substrat de montage général sur la surface dorsale du GM, puis aplatez le tissu avec un bloc de verre avant l’imagerie. Dans le logiciel, réglez la longueur d’onde d’excitation à 646 nanomètres. Après avoir ajouté deux gouttes de solution de clairipage deux, sélectionnez l’objectif 63X pour imager le muscle TA, et réglez la profondeur de la pile Z près de 100 micromètres.

Ensuite, sélectionnez le mode déconvolution et appliquez des paramètres optimisés pour le système. Réglez la taille du pas à un micromètre et acquérez des images. Pour acquérir des images des cellules de Schwann terminales, sélectionnez l’objectif à grossissement de 20 fois, réglez la profondeur de la pile Z à environ 17 micromètres, et acquérez des images.

Ensuite, sélectionnez l’objectif à grossissement 63 fois et prenez des images des cellules de Schwann terminales individuelles. Importez des tranches Z individuelles pour entraîner le logiciel à reconnaître le signal mitochondrial. Et réaliser des analyses quantitatives à l’aide de logiciels pilotés par l’IA.

Développer des masques d’image pour la revue par l’enquêteur. Séparez les empilements d’images 3D en sections optiques individuelles après optimisation par algorithme. Sélectionnez chaque cinq tranches Z de chaque image 3D, et calculez la moyenne par échantillon.

Standardiser les paramètres d’imagerie sur tous les échantillons et quantifier la morphologie mitochondriale. Effectuer une immunohistochimie et des analyses statistiques pour évaluer les différences et corrélations entre groupes. La connectivité mitochondriale était réduite dans le muscle mdx par rapport aux souris sauvages.

Un plus grand nombre de petits fragments mitochondriaux et un nombre réduit de grands réseaux mitochondriaux interconnectés ont été observés chez des souris mdx. Chez les souris de type sauvage, les mitochondries dans les cellules terminales de Schwann présentaient des structures en boucle interconnectées près des bifurcations. En revanche, chez les souris mdx, les mitochondries apparaissaient fragmentées et manquaient de formation de boucles près des bifurcations.

La microscopie confocale et électronique a confirmé des structures mitochondriales similaires en forme de beignet dans les cellules terminales de Schwann. L’analyse postsynaptique a montré des mitochondries sub-sarcolemmales regroupées autour des récepteurs de l’acétylcholine, sans la structure caractéristique de type bretzel (bretzel). L’analyse d’images a révélé que les mitochondries terminales des cellules de Schwann dans le muscle mdx présentaient une surface et une fragmentation accrues par rapport au muscle de type sauvage, sans différence de taille relative des particules.

Les mesures de la force musculaire ont montré une réduction des contractions avec une plus grande variabilité et une diminution de la force de pointe dans le muscle mdx. La production de force à travers l’augmentation des fréquences de stimulation a également été significativement réduite dans les muscles mdx. Le muscle mdx a montré un décalage vers la gauche de la taille des fibres, indiquant environ 60 % de myofibres plus petites que les types sauvages.

Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier et de quantifier la morphologie mitochondriale du muscle squelettique et des cellules terminales de Schwann. De futures études pourront adapter cette approche pour étudier la morphologie mitochondriale dans la microcirculation et les vaisseaux lymphatiques.