Un modèle préclinique de la synovite utilisant un tissu synovial humain ex vivo avec fonction et architecture préservées

Les principales questions auxquelles nous voulons répondre sont les suivantes : quelle est la réponse immunitaire synoviale native aux stimuli infectieux et inflammatoires, et comment cela se reflète-t-il dans les altérations de la structure synoviale ? Mon principal domaine clinique et de recherche est le traitement des patients morbidement obèses atteints d'arthrite RC en phase terminale. Fréquemment, dans cette population de patients, ils ont été médicalement négligés en raison de leurs difficultés à trouver des options de traitement chirurgical pour leur maladie.

Pour commencer, effectuez une arthrotomie et une dissection en salle d'opération. Utilisez une approche médiale parapatellaire standard et effectuez une exposition plus extensive lorsque vous opérez un patient atteint d'obésité morbide et d'arthrose en phase terminale. Identifiez le synovium antérieur et utilisez l'électrocautère pour disséquer le tissu.

Observez le genou pour détecter des signes d'inflammation, car les patients obèses peuvent présenter une réponse inflammatoire locale qui est corrélée avec les effets inflammatoires plus larges de l'obésité. Passez le synovium au membre de l'équipe de recherche de manière stérile. Placez le récipient d'échantillon rempli de PBS de Dulbecco froid ou DPBS sur de la glace et transférez le tissu synovial antérieur humain acquis lors de l'arthroplastie totale du genou dans le récipient.

Lavez le tissu deux fois dans du DPBS froid pendant 10 minutes sur une plaque agitatrice. Ensuite, transférez le synovium dans une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres ou plus sous un cabinet de sécurité biologique de niveau 2. Ajoutez du DMEM stérile à faible teneur en glucose contenant du pyruvate de sodium et de la L-glutamine pour remplir le plat à mi-hauteur.

Identifiez la doublure synoviale par la couche intime nacré, sans l'enlever. Disposez les outils requis pour obtenir des noyaux de biopsie de trois millimètres pour au moins deux répétitions techniques. À l'aide de ciseaux iris ou d'un scalpel, disséquez le tissu adipeux et stroma superflu du côté cauterisé pour isoler le synovium, en maintenant une profondeur de tissu d'environ quatre à cinq millimètres tout au long.

Changez le milieu de la boîte de Pétri si nécessaire pour maintenir le champ de vision. Positionnez le tissu avec la doublure synoviale face à l'outil de perforation. Stabilisez le tissu avec la main non dominante à l'aide de pinces ou d'hémostatiques, et percez le tissu en appliquant une pression perpendiculaire ferme avec un léger mouvement de torsion.

Remplacez le poinçon de biopsie après environ 10 à 15 utilisations, ou lorsque le tissu se tord pendant le perçage pour éviter d'endommager la structure de la doublure intime. Ouvrez une deuxième boîte de Pétri et remplissez-la de cinq à dix millilitres de milieu contenant du FBS 10% à 37 degrés Celsius. Avec des pinces plates ou non denticultées, transférez les noyaux dans le plat et agitez doucement pendant une à deux secondes pour éliminer les débris sans les pincer fermement.

Pour préparer le puits inférieur du système d'analyse de l'espace articulaire, ajoutez 600 microlitres de DMEM à faible teneur en glucose contenant 10% de FBS à 37 degrés Celsius. Ajoutez le contrôle véhicule ou le réactif de traitement de votre choix, tel que LPS ou MCP-1, dans le puits inférieur. Sélectionnez la taille des pores de la transwell en fonction du résultat expérimental souhaité, et ajoutez 300 microlitres de DMEM à faible teneur en glucose contenant 10% de FBS dans la transwell.

À l'aide de pinces stériles, transférez délicatement les noyaux de tissu individuels dans le milieu de la transwell, en évitant les noyaux effilochés et flottants. Ensuite, placez l'assemblage dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant huit à 72 heures selon les analyses en aval à effectuer. Fixez le tissu synovial dans du formalin tamponné neutre à 10%.

Ensuite, incorporez-le et coupez-le pour une analyse histologique. Après coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, imagez les sections de tissu à 10X et 40X à l'aide d'un microscope en champ clair. Utilisez Photoshop pour délimiter les régions de la doublure intime et du sous-doublure dans l'image TIFF 40X, en masquant les zones non ciblées, les érythrocytes et les gros vaisseaux pour une analyse quantitative ultérieure.

Analysez les masques finaux pour quantifier l'épaisseur, l'intégrité et la cellularité de la doublure intime et du sous-doublure. Enfin, évaluez les cellules migratrices par cytométrie en flux et les facteurs solubles dans le milieu collecté par dosage immunoenzymatique. Le tissu synovial cultivé avec des doses croissantes de MCP-1 ou de LPS a montré des changements distincts de la morphologie de la doublure intime, notamment une doublure intime friable et une doublure intime épaissie avec une densité cellulaire diminuée par rapport au contrôle.

Le traitement par MCP-1 et LPS a modifié la réponse cytokine synoviale. MCP-1 a induit l'expression du marqueur fibroblastique pathogène podoplanine dans le sous-doublure, tandis que le LPS a augmenté la podoplanine à la fois dans la doublure intime et dans le sous-doublure. Les cellules immunitaires migratrices dans le puits inférieur comprenaient des neutrophiles, des cellules NK, des cellules NKT, des cellules T, des cellules B ou des cellules dendritiques, des monocytes ou des macrophages, et des macrophages M2.

Les cellules T étaient les cellules immunitaires migratrices les plus abondantes. Statistiquement, il n'y avait pas de différence dans la migration cellulaire en fonction du stimulus du puits inférieur. L'ostéoprotégérine, une protéine pertinente pour l'arthrite, a été détectée à 24, 48 et 72 heures dans le synovium arthritique cultivé non traité et était significativement plus élevée à 72 heures qu'à 24 heures.

L'expression de la synthase inductible de l'oxyde nitrique dans la doublure intime était élevée chez les témoins à zéro heure et était presque absente après 24 heures. L'expression de la synthase de l'oxyde nitrique a été maintenue lorsqu'elle a été traitée avec de la N-acétyl cystéine. À l'inverse, la N-acétyl cystéine n'a pas modifié l'expression de la métalloprotéinase de la matrice-9, un marqueur à la fois de la synovite et de dommages potentiels au cartilage.

Ce protocole permet aux chercheurs d'étudier les altérations des couches intimes et sous-doublures synoviales, y compris la profondeur, la cellularité et l'intégrité, qui sont toutes indicatives d'une inflammation. Les considérations les plus importantes lors de l'exécution de ce protocole sont l'acquisition de tissus viables auprès de donneurs appropriés, la stérilité et l'identification de la doublure intime pour la sélection de la biopsie. Des études futures évalueront l'amélioration de la durée de culture des