Une méthode simplifiée pour la transformation médiée par l’agrobactérie de Phytophthora palmivora

Ce protocole offre un système simple, efficace et reproductible pour transformer Phytophthora palmivora et Phytophthora capsici. Pour commencer, prenez une nouvelle plaque de tarière LB complétée avec des antibiotiques. Ajoutez 20 microlitres de milieu liquide LB au centre de la plaque et extrayez les cellules d’agrobacterium d’une plaque déjà cultivée avec un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 millilitre.

En utilisant le fond et la base plate du tube, répartez les cellules uniformément sur la plaque. Faites couver la plaque toute la nuit à 28 degrés Celsius pendant environ 16 à 18 heures. Ensuite, prélevez les cellules d’agrobactérie qui ont grandi pendant la nuit à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre.

Resuspendez les cellules dans un millilitre de milieu d’induction agrobactérium en pipettant vers le haut et vers le bas. Maintenant, transférez les cellules en suspension dans un tube stérile de 50 millilitres recouvert de papier aluminium et ajoutez un milieu d’induction agrobactérien. Mesurez la densité optique de l’échantillon à 600 nanomètres et diluez-le avec un milieu d’induction agrobactérien pour obtenir une densité optique de 0,4.

Puis desserrez le couvercle du tube recouvert de feuille d’aluminium contenant la suspension bactérienne. Placez-le sur un trembleur de plateforme avec une légère agitation à environ 70 tours par minute. Inondez une plaque de phytophthora palmivora vieille de sept à huit jours avec 10 millilitres d’eau pré-refroidie à quatre degrés Celsius.

Utilisez une pointe de pipette pour tapoter doucement la surface et éliminer les bulles d’air sur le substrat. Faites couver l’assiette à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, transférez-le à température ambiante sous la lumière pendant encore 15 minutes.

À l’aide d’une pipette, transférez doucement environ sept à huit millilitres de zoospores libérées dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres sans perturber les mycélium et les sporanges. Ensuite, transférez 20 microlitres de la suspension zoospore dans un tube de microcentrifuge de 1,5 millilitre, puis ajoutez 180 microlitres d’eau pour diluer la suspension dix fois plus. Faites un vortex dans le tube pendant une minute pour insister sur les zoospores et utilisez un hémocytomètre au microscope pour compter les zoospores.

Ajoutez cinq millilitres de la suspension d’agrobactérie préparée à cinq millilitres de suspension zoospore dans un tube stérile recouvert de feuille d’aluminium de 50 millilitres. Mélangez délicatement le contenu, desserrez le couvercle du tube et laissez-le reposer à température ambiante pendant deux heures. Pendant l’incubation, préparez les plaques AZCA.

Une fois le milieu solidifié, placez une pièce de membrane Hybond-N+ stérilisée sur la plaque et gardez la plaque dans l’obscurité. Après deux heures de co-incubation, utilisez une pointe de pipette pour étaler 300 microlitres du mélange sur la membrane Hybond-N+, en veillant à ce que les marges soient libres du liquide. Laissez les boîtes de Petri découvertes dans la hotte pendant environ 10 minutes pour laisser le mélange sécher à l’air.

Une fois que le liquide cesse de bouger sur la membrane, couvrez les plaques. Incubez les plaques couvertes à 25 degrés Celsius dans le noir pendant deux jours. Après 48 heures d’incubation, utilisez des pinces stérilisées pour transférer la membrane Hybond-N+à l’envers sur la plaque de tarière Plich sans la traîner sur la surface de la tarière.

Utilisez la base plate d’un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour presser et glisser doucement sur la surface de la membrane afin d’assurer un contact complet avec le milieu. Vérifiez le dessous de la plaque pour détecter des bulles d’air et appuyez doucement sur la même base plate. Incubez la plaque à 25 degrés Celsius sous un cycle de lumière de 12 heures et un cycle d’obscurité de 12 heures pendant deux à trois jours.

Enfin, après deux à trois jours d’incubation, retirez la membrane à l’aide d’une pince stérile et continuez à incuber la plaque dans les mêmes conditions de lumière et de température. La co-incubation des zoospores de Phytophthora palmivora avec l’agrobacterium tumefaciens EHA 105 exprimant pCB301TOR-GFP a donné des colonies résistantes à G418 sur une vis sans fin Plich complétée par 30 microgrammes par millilitre G418, tandis qu’aucune colonie n’est apparue sur les plaques témoins sans infection agrobactérienne. Le nombre de transformants résistants à G418 par 10 pour la puissance sept zoospores était de 55 dans l’expérience un et de 50 dans l’expérience deux.

La microscopie à fluorescence a confirmé un signal protéique fluorescent vert clair chez les transformants de Phytophthora palmivora. De plus, ce protocole a été appliqué à Phytophthora capsici pour générer avec succès des transformants exprimant la GFP. Notre protocole permet aux chercheurs d’étudier les fonctions géniques, de déterminer la localisation cellulaire des protéines et de suivre la dynamique des infections par les agents pathogènes.

Ces protocoles peuvent générer un faible pourcentage de faux positifs et nécessitent donc des approches supplémentaires pour confirmer les véritables transformants. L’application de ce système de transformation peut s’étendre à d’autres oomycètes et champignons. Nous tenterons également de simplifier davantage ce protocole à l’avenir.