Une plateforme novatrice pour l’étirement et l’imagerie cellulaire in vitro

Notre objectif était de développer un dispositif d’étirement cellulaire compatible avec un microscope à faible coût inspiré de Hoberman afin d’étudier comment l’étirement mécanique influence la fonction cellulaire. Cet appareil permet aux chercheurs d’étudier les réponses des cellules vitales aux stimuli mécaniques, imitant des systèmes physiologiques tels qu’un cœur battant ou des poumons respiratoires. Pour commencer, là où l’équipement de protection individuelle est approprié.

Mélangez la base de Silgard 184 et l’agent de durcissement dans un ratio de 10 pour un dans un plat en plastique. Avec un abaisse-langue, mélangez vigoureusement les composants pendant deux à trois minutes. Ensuite, placez la plaque dans une chambre de dégazage pendant une heure.

Ensuite, prenez les moules imprimés en 3D préparés et ajoutez 1,3 gramme du mélange PDMS dans le moule isotrope. Ensuite, ajoutez 0,5 gramme du mélange PDMS au moule uniaxial. Étalez le gel uniformément sur le moule et dégazez le moule rempli pendant une heure.

Laissez le gel dans le moule se déposer sur une surface plane à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, fais sécher la moisissure au four à 60 degrés Celsius toute la nuit. Ensuite, mélangez les parties A et B du gel NuSil 8100 en proportions égales.

Mélangez le gel combiné avec le réticulateur Silgard 184 à 0,36 % du volume total pour obtenir une rigidité du substrat de 13 kilopascal. Pour obtenir un substrat mou avec une rigidité de 0,3 kilopascal, évitez d’ajouter le réticulateur, puis mélangez la solution en roulaille pendant 15 minutes. Placez le mélange NuSil dans une chambre de dégazage et dégazez pendant 30 minutes.

Retirez soigneusement le gel PDMS du moule personnalisé et placez-le sur une gaine de couvercle de 40 millimètres sans le déchirer. Ensuite, placez le gel PDMS dans le codeur de spin. Pipeter 100 microlitres du mélange NuSil sur la zone négative du gel isotrope PDMS.

Ensuite, pipettez 50 microlitres du mélange NuSil sur la zone négative du gel PDMS uniaxial. Après cela, code à sept G pendant 50 secondes. Atteindre une épaisseur de 100 micromètres.

Laissez le gel enduit se déposer sur une surface plane à température ambiante pendant deux heures. Placez le gel au four et séchez à 60 degrés Celsius toute la nuit. Désormais, les cellules des voies respiratoires humaines, les cellules musculaires lisses dans des puits de culture cellulaire élastiques et les incubent dans des conditions standard.

Ensuite, mélangez les cellules avec la solution de calcium six de FLIPR pour l’imagerie. Pour la mesure de la force de traction, recouvrir les substrats du gel NuSil du PDMS d’une couche de billes fluorescentes servant de marqueurs fiduciaux. Préparez une solution à 0,025 % de microsphères rouges carboxylate fluorescentes modifiées d’un micromètre de diamètre dans le HBSS.

À l’aide d’un mélangeur vortex, faites passer la solution de billes pendant 10 secondes. Ensuite, pipeter 880 microlitres de la solution de billes dans le gel isotrope. Ajoutez 420 microlitres de la solution de billes au gel uniaxial.

Après avoir incubé le gel à température ambiante pendant une heure, retirez soigneusement la solution de billes pour préserver la distribution des billes. Ensuite, utilisez un coton-tige ou une lingette de laboratoire pour taper doucement toute solution résiduelle sur la surface du gel. Ensuite, utilisez un microscope inversé équipé d’un appareil photo, d’un moteur léger et d’un objectif sec 10 x.

Réglez l’excitation à 475 par 40 nanomètres et l’émission à 555 par 50 nanomètres. Acquérir des images 16 bits à un taux d’images de deux hertz lors d’expériences d’étirement. Placez maintenant du gel isotrope sur la civière, puis imagez les billes fluorescentes à l’aide d’un microscope inversé équipé d’un objectif sec 10 fois. Capturez des images en condition pré-étirement.

Capturez en continu des images tout au long du protocole d’étirement au centre du substrat. Refocalisez le microscope à la position étirée si nécessaire avant de prendre des images. Analysez les images en utilisant un code MATLAB personnalisé basé sur la microscopie de la force de traction de Furier pour calculer les vecteurs de déplacement et les champs de déformation planaire correspondants.

Représentez les données comme la moyenne des essais finaux. L’application d’un déplacement de 240 micromètres faisait que les billes fluorescentes se déplaçaient radialement vers l’extérieur depuis le centre. La microscopie de la force de traction a révélé un champ de déplacement isotrope avec des vecteurs rayonnant depuis le centre et augmentant en magnitude avec la distance.

Le champ de déplacement isotrope générait un champ de déformation planaire homogène. Augmenter le déplacement à 1000 micromètres a donné des vecteurs de déplacement qui ont augmenté en magnitude tout en maintenant une orientation radiale. Le champ de déformation correspondant à 1000 micromètres a augmenté en magnitude tout en restant radialement symétrique.

Dans les gels uniaxiaux soumis à un déplacement de 250 micromètres, les vecteurs de déplacement étaient principalement alignés sur un seul axe, cohérent avec la déformation uniaxiale. Les formes d’onde de déformation reflétaient étroitement les déplacements moteurs programmés et restaient synchronisées sur trois cycles répétés. Les valeurs de déformation au déplacement maximal sont restées constantes sur trois échantillons indépendants.

L’application d’un déplacement transitoire allant jusqu’à 5 555 micromètres produisait des souches allant de plus de 0,1 % à 12 %. Une déformation transitoire de 0,5 % induisait une augmentation du calcium intracellulaire, visible par une intensité de fluorescence plus élevée après étirement. Grâce à notre brancard, les chercheurs peuvent réaliser des images du calcium à cellules vivantes, une microscopie de force de traction et quantifier les réponses mécaniques cellulaires à l’étirement isotrope ou uniaxial. Une étape cruciale consiste à s’assurer que les gels durcissent sur une surface plane car une épaisseur inégale peut déverser le substrat et réduire la clarté optique lors de l’imagerie en direct.

Des études futures pourront étudier la réorientation cytosquelettique induite par l’étirement, les troubles pathologiques liés à l’asthme ou aux lésions pulmonaires, ainsi que sur divers types cellulaires.