Modulation cholinergique dépendante des ligands du couplage oxydatif par phosphorylation dans les cellules neuroblastomes BE(2)-C perméméabilisées à la digitonine

L’objectif global de cette expérience est de démontrer une méthode permettant d’évaluer la bioénergétique mitochondriale dans des cellules de neuroblastome cultivées intactes en utilisant la perméabilisation sélective et la combinaison d’inhibiteurs de substrat. Traditionnellement, la respiration mitochondriale est évaluée à l’aide d’instruments tels que le respiromètre haute résolution Oroboros O2K, l’électrode d’oxygène de type Clark et l’analyseur Seahorse XF. Les méthodes traditionnelles qui reposent sur une fraction mitochondriale isolée ou enrichie provenant des tissus ou des cellules compromettent souvent la structure mitochondriale.

Par exemple, cette image au microscope électronique à transmission des mitochondries isolées dans le cortex de souris révèle un contraste marqué d’intégrité structurelle selon que les mitochondries sont encapsulées dans les terminaux présynaptiques ou non. Les mitochondries qui restent encapsulées dans les terminaux présynaptiques semblent structurellement intactes, comme l’indiquent les flèches cyan sur cette image. En revanche, les mitochondries non encapsulées ou dépourvues de structure membraneuse environnante apparaissent souvent déformées, comme le représentent les flèches jaunes.

L’analyseur Seahorse Flex est couramment utilisé pour étudier la bioénergétique mitochondriale dans les cellules cultivées et dans les mitochondries isolées. Dans l’analyse basée sur des cellules cultivées, l’architecture cellulaire et les réseaux de signalisation sont préservés. Cependant, la membrane plasmique des cellules intactes est imperméable à de nombreux substrats du cycle de l’acide tricarboxylique.

Cela limite la portée de l’analyse métabolique par rapport aux mitochondries isolées, qui ne possèdent pas de barrière membranaire plasmique, mais présentent souvent les artefacts structurels. Ainsi, les deux systèmes ont des limites inhérentes. La technique présentée ici exploite le fait que la membrane plasmique est riche en cholestérol, tandis que la membrane mitochondriale en contient très peu.

En utilisant un détergent liant le cholestérol comme la diguonine, nous pouvons perméabiliser sélectivement la membrane plasmique tout en laissant la membrane mitochondriale intacte. Cette approche permet une entrée contrôlée des substrats mitochondriaux et des inhibiteurs dans la cellule sans compromettre l’intégrité des organites. Ainsi, cette technique permet une analyse fonctionnelle des mitochondries dans le contexte de cellules intactes, combinant l’avantage de l’architecture globale de la cellule avec l’accessibilité de tests mitochondriaux isolés.

Commencez l’expérience avec une antenne de culture sub-confluente de vos cellules. Lavez doucement les cellules avec un tampon phosphate stérile. Ajoutez un volume approprié de solution Triton pour recouvrir uniformément la monocouche cellulaire. Après l’incubation, retirez le plat et tapotez-le doucement ou secouez-le horizontalement pour aider à déloger les cellules.

À l’aide d’une pipette de cinq ml et d’un contrôleur de pipette, faites monter et descendre la suspension de la cellule plusieurs fois pour défaire tout amas et obtenir une suspension à cellule unique. Examinez la suspension cellulaire au microscope pour confirmer une suspension unicellulaire uniforme. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.

Ajustez la concentration cellulaire de sorte que 100 microlitres de suspension contiennent environ 10 000 cellules. Accélérez soigneusement 100 microlitres de suspension à cellules dans chaque puits de la plaque de test Seahorse XF. Laissez-en un bien vide pour servir de contrôle de fond pendant l’analyse.

Incubez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant deux à trois heures afin de permettre aux cellules d’adhérer au fond du puits. Une fois les cellules attachées, ajoutez doucement 300 microlitres de média d’essai à chaque puits. Retournez la plaque dans l’incubateur et incubez toute la nuit pour permettre aux cellules de se stabiliser et de croître.

Assurez-vous que les cellules forment une monocouche uniforme au fond de chaque puits. Évitez la surpopulation. Les cellules doivent être confluentes, mais pas surconfluentes, afin d’assurer une performance optimale au test.

La veille de l’expérience, hydratez la cartouche de capteur XFp 24 en ajoutant un ml de tampon de calibration à chaque puits. Sinon, vous pouvez utiliser du sérum tampon phosphate, pH 7,4. Laissez la cartouche à température ambiante toute la nuit sur le lit.

L’incubation dans un incubateur non COT à 37 degrés Celsius n’est pas nécessaire car la cartouche s’équilibrera à température ambiante pendant le chargement. Appelez toutes les solutions de stock congelées et 2x tampon de test microglial à température ambiante. Vérifie le pH, il devrait être à 7,4.

Ajustez si besoin. Préparez tout le substrat et les solutions d’injection et vérifiez à nouveau le pH. Gardez toutes les solutions sur la glace jusqu’à utilisation.

Préparez des tubes alimentaires étiquetés A, B, C et D pour les solutions de port d’injection de cartouche de capteur. Il est préférable de fabriquer des solutions contenant des inhibiteurs ou substrats respectifs pour chaque port. À l’aide d’une pipette multicanal, chargez soigneusement 50 microlitres de chaque solution de port d’injection dans les ports respectifs, de A à D.

Démarrez le bioanalyseur Seahorse une à deux heures avant l’expérience pour permettre à l’incubateur interne de se stabiliser à 37 degrés Celsius. Étiquetez chaque puits et regroupez selon votre conception expérimentale et les directives de Wave Desktop 2.6. Programmez le bioanalyseur pour le mélange, le poids et le cycle de mesure appropriés.

Voir le tableau 8 pour référence. Il est important de désactiver l’option d’équilibrage au début du cycle de mesure. Le garder allumé prolongera inutilement l’expérience et pourrait épuiser les substrats.

Démarrez la machine va d’abord calibrer la cartouche capteur, ce qui prend environ 15 minutes. Commencez à préparer la plaque cellulaire juste après avoir placé la cartouche capteur en calibration. Aspirez soigneusement le tampon sans perturber les cellules à environ 700 microlitres de tampon mitochondrial 1x vers chaque puits avec les cellules adhérentes, puis laissez la plaque reposer une minute pour s’équilibrer.

Aspirez soigneusement le tampon de chaque puits sans perturber les cellules adhérentes. Répétez l’étape de la machine à laver trois fois pour garantir un matériau complet. En parallèle, ajoutez 50 microlitres de tampon mitochondrial à un puits de fond sans cellules.

Utilisez le ménisque comme référence visuelle pour la constance du volume. Aspirez soigneusement le tampon des puits contenant les cellules, en laissant environ 50 microlitres pour maintenir l’hydratation cellulaire. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius, soit dans un bain-marie, en la gardant au-dessus de la surface de l’eau, soit dans un incubateur non en acier avec une atmosphère saturée pour éviter l’évaporation.

Juste avant de charger dans l’analyseur, ajoutez 450 microlitres de tampon mitochondrial préchauffé contenant des substrats, inhibiteurs ou médicaments selon les besoins dans chaque puits, portant le volume total à 500 microlitres. La plaque est désormais prête à exécuter le test en utilisant la cartouche capteur calibrée du bioanalyseur Seahorse. Tout d’abord, nous réalisons un test de couplage pour examiner le degré de couplage entre le système de transport des électrons et la phosphorylation oxydative.

Le test de couplage aide à distinguer la fonction mitochondriale de la dysfonction. Dans ce schéma du système de transport mitochondrial des électrons, nous montrons que les inhibiteurs spécifiques complexes un, trois et cinq, ainsi que les nœuds pour différents substrats tels que le pyruvate ou le malate et le succinate, donnent les électrons au système. Cette visualisation est utile pour comprendre comment fonctionne le test et le rôle des différents substrats et inhibiteurs.

Nous examinons d’abord deux concentrations différentes de la diguégonine, cinq micromolaires et dix micromolaires, pour évaluer leur efficacité à faciliter le transport des électrons à travers la membrane plasmique et à permettre le test de couplage. Dans cet essai, le niveau de couplage respiratoire a été évalué en mesurant séquentiellement le taux de consommation d’oxygène en présence de succinate comme substrat, et de roténone comme inhibiteur du complexe 1. ADP, oligomycine, FCCP et antimycine A ont ensuite été injectés séquentiellement, et des mesures OCR ont été enregistrées après chaque injection.

Le panneau de gauche montre des graphiques linéaires représentant la cinétique de la tension de l’oxygène dans la microchambre transitoire. En général, cette valeur doit rester entre 100 et 200 millimètres de mercure afin d’assurer la détection dans la plage dynamique du capteur. Ces ensembles de données ont été générés en mode point à point dans le logiciel Agilent Wave, qui affiche l’OCR comme une série de taux sur la période de mesure, permettant la visualisation des changements dynamiques, notamment 10 micromolaires de la digidonine augmentant le transport des succinates par rapport à cinq micromolaires, ce qui entraîne une tension d’oxygène plus faible dans la microchambre et, par conséquent, une absorption d’oxygène plus élevée.

L’analyse des données obtenues lors de ces expériences a révélé que la respiration basale médiée par les complexes deux à quatre était significativement plus élevée à 10 micromolaires de la digitonine comparée à cinq micromolaires, indiquant un transport des succinates plus efficace à travers la membrane plasmique perméabilisée à des concentrations plus élevées. Sur la base de cette observation, et étant donné que 10 micromolaires de la digitonine offraient une perméabilisation optimale, nous avons ensuite réduit le nombre de cellules à 20 000 cellules par puits pour réduire la respiration basale. Cet ajustement a permis de garantir que toute amélioration respiratoire induite par un médicament ou un substrat reste dans la plage de détection dynamique du système.

Une fois la concentration de la digitonine et le nombre de cellules optimisés, le prochain test de couplage a été réalisé pour évaluer les effets des agonistes muscariniques et des antagonistes sur la respiration mitochondriale. Une découverte importante de cet ensemble d’expériences a été que, dans les cellules non traitées de la digitonine, la respiration basale médiée par les complexes succinés de deux à quatre ainsi que la respiration d’état 3 et 3u était significativement réduite. Cela indique que le succinate n’a pas été transporté dans la cellule dans des conditions non perméabilisées.

L’analyse des données issues de plusieurs expériences indépendantes a révélé que l’antagoniste muscarinique atropine réduisait significativement la respiration basale médiée par des complexes deux à quatre dans les cellules neuroblastomiques par rapport à l’agoniste muscarinique acétylcholine, qui maintenait un niveau respiratoire élevé. De plus, la respiration des états 3 et 3u étaient significativement plus faibles dans les cellules non perméabilisées que dans les cellules perméabilisées, soulignant l’efficacité de la diguenine à perméabiliser sélectivement la membrane plasmique sans altuer la fonction mitochondriale. Le test de flux d’électrons évalue le transfert séquentiel d’électrons vers la chaîne de transport mitochondriale, aidant à identifier les mécanismes de dysfonctionnement ou de modulation mitochondriale.

Lors de la phase initiale du test, les cellules ont été traitées avec du pyruvate, du malate et du FCCP, ce qui a induit un niveau élevé de respiration non couplée provoquée par les complexes un à quatre. L’ajout ultérieur de roténone a inhibé le complexe un, réduisant la respiration basale et isolant l’activité du complexe deux à quatre. Bien que nous n’ayons pas observé de différences significatives entre les conditions traitées par médicament et celles témoins, une observation importante était que la respiration de l’état 3u par les succinates était significativement plus faible dans les cellules non perméabilisées, ce qui indique le rôle crucial de la diguonine dans l’entrée des succinates dans la cellule.

En résumé, ce protocole offre un moyen fiable d’étudier la bioénergétique mitochondriale. Il combine la pertinence physiologique de l’architecture cellulaire entière avec la précision des tests mitochondriaux isolés, permettant une administration contrôlée des substrats et inhibiteurs tout en préservant l’intégrité des organites. En optimisant la concentration de la digitonine et la densité cellulaire, les chercheurs peuvent obtenir des mesures précises et reproductibles.

Cette approche adaptable est idéale pour explorer la modulation médiée par récepteurs de la fonction mitochondriale et offre une base puissante pour la recherche sur les maladies et la découverte de médicaments.