Profilage d’accessibilité par chromatine chez les larves L4 de Caenorhabditis elegans
17 avril 2026
Ici, nous présentons un protocole ATAC-seq rapide et simple à implémenter dans un ver entier de Caenorhabditis elegans à étage L4 utilisant seulement 30 μL de pastille de ver.
Notre recherche se concentre sur la façon dont la régulation épigénétique façonne l'expression des gènes, en particulier sur la façon dont l'accessibilité de la chromatine contrôle l'activité des gènes dans différentes conditions biologiques. L'ATAC-seq chez C. elegans est limité par sa cuticule protectrice. Nos protocoles surmontent cette barrière pour permettre une analyse fiable de l'accessibilité de la chromatine.
Pour commencer, obtenez une population synchrone de vers L1 et laissez-les grandir pendant 26 heures à 20 degrés Celsius. Confirmez sous le microscope que la plupart des vers sont au stade L4. Récupérez tous les vers des plaques avec du tampon M9 et transférez-les dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.
Lavez les vers cinq fois avec un millilitre d'eau stérile en les laissant se déposer par gravité. Ensuite, transférez le tube contenant les vers dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes pour éliminer les restes d'aliments intestinaux. Prélevez ensuite 50 microlitres du pellet de vers et placez-le dans un nouveau tube.
Pour lyser les vers, ajoutez 200 microlitres de tampon SDS-DTT frais et mélangez dans un rotateur de tube pendant exactement cinq minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon d'œufs froid. Puis centrifugez sur un picofuge pour éliminer le surnageant et répétez six fois.
Ensuite, ajoutez 80 microlitres de pronase fraîchement préparée. En utilisant une pipette de 200 microlitres avec des embouts filtrés, mélangez le mélange de vers et de pronase 70 fois et incubez-le à température ambiante pendant 15 minutes. Ajoutez 800 microlitres de milieu L15 à 10% de sérum bovin fœtal et centrifugez à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après l'élimination du surnageant, ajoutez un millilitre de milieu L15 à 10% de sérum bovin fœtal et centrifugez comme démontré précédemment. Une fois que le pellet est lavé trois fois, éliminez le surnageant et remettez le pellet en suspension dans 900 microlitres de milieu L15 à 10% de sérum bovin fœtal. Filtrez ensuite la suspension à l'aide d'un filtre de 20 micromètres.
Centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminez le surnageant, en laissant environ 50 microlitres. Ajoutez 45 microlitres de tampon de lyse fraîchement préparé et remettez soigneusement le sample en suspension.
Ajoutez ensuite soigneusement 50 microlitres de tampon de lavage sans mélanger l'échantillon. Centrifugez à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et conservez l'échantillon sur de la glace.
Pendant la centrifugation, préparez le mélange TN5 par échantillon en combinant 25 microlitres de tampon TN5, 24,8 microlitres d'eau exempte de nucléase et 0,2 microlitres d'enzyme TN5. Après centrifugation, éliminez le surnageant et conservez les noyaux sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres de mélange TN5 au pellet nucléaire.
Pipettez ensuite vers le haut et vers le bas sept fois pour mélanger. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sur un bloc thermique et tapotez doucement le tube toutes les 10 minutes. Après l'incubation TN5, ajoutez 300 microlitres de tampon PB et mélangez en vortex à vitesse maximale pendant 25 secondes.
Transférez tout le volume du tube dans la colonne de centrifugation. Centrifugez à température ambiante pendant une minute à vitesse maximale. Ajoutez 750 microlitres de tampon PE à la colonne de centrifugation et centrifugez à nouveau.
Puis jetez le surnageant avec le tube de collecte. Après une centrifugation à vide, placez la colonne dans un nouveau tube de 1,5 millilitre étiqueté. Ajoutez 10 microlitres de tampon EB à 37 degrés Celsius au centre de la colonne sans le toucher.
Laissez reposer à température ambiante pendant une minute. Puis centrifugez pendant une minute à vitesse maximale à température ambiante. Répétez ensuite les étapes d'élution pour obtenir un volume final de 20 microlitres dans le tampon EB.
Effectuez une PCR en temps réel pour estimer le nombre de cycles d'amplification approprié pour l'amplification de la bibliothèque ATAC. Estimez le nombre de cycles d'amplification final en sélectionnant le cycle auquel le signal d'amplification atteint 1/3 de son maximum pour chaque échantillon. Effectuez l'amplification finale de la bibliothèque ATAC et attribuez un primer inverse différent à chaque échantillon et enregistrez-le.
Amplifiez chaque échantillon pour le nombre de cycles estimé pour cet échantillon. Effectuez la réaction en chaîne par polymérase présentée dans des tubes de 200 microlitres en utilisant 10 microlitres de bibliothèque d'ADN dans un volume total de réaction de 50 microlitres. Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius si le protocole est mis en pause.
Après avoir purifié la bibliothèque amplifiée, effectuez une électrophorèse capillaire pour visualiser le motif de distribution des tailles des fragments. La courbe d'amplification résultant en une amplification finale de la bibliothèque estimée à moins de 15 cycles indique un matériel de bonne qualité, adapté à la poursuite. La courbe d'amplification montrant une augmentation retardée indique un matériel de mauvaise qualité et ne doit pas être poursuivie.
La distribution des longueurs de fragments après amplification a montré des motifs nucléosomales à environ 150 paires de bases et 300 paires de bases dans les échantillons valides. Un motif de fragments estompé indiquait un ADN sur-fragmenté nécessitant la répétition de l'échantillon. Notre protocole permettra un profilage de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome dans des vers entiers pour comprendre comment les environnements influencent la régulation des gènes.
Le défi principal consiste à équilibrer l'apport de vers et l'activité de TN5 pour éviter une tagmentation insuffisante ou excessive, assurant un profilage optimal de l'accessibilité de la chromatine. Cette approche ouvre des opportunités pour étudier la variation épigénétique à travers des isolats sauvages, des conditions environnementales et même des espèces alternatives.
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Aperçu
Cet article présente un protocole optimisé pour réaliser le séquençage ATAC (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) sur des vers entiers de Caenorhabditis elegans au stade de développement L4. La méthode surmonte les difficultés posées par la cuticule riche en collagène du nématode, permettant un profilage efficace de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome avec un nombre minimal de cellules. Le flux de travail simplifié facilite l'étude de la dynamique de la chromatine en réponse à des modifications génétiques et environnementales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génomique
- Épigénétique
- Biologie moléculaire
Contexte
- L'accessibilité de la chromatine est cruciale pour la transcription, la réparation de l'ADN et la ségrégation des chromosomes.
- Les régions de chromatine hyperaccessibles sont associées aux promoteurs et aux enhancers actifs.
- La technique ATAC-séq permet la cartographie à l'échelle du génome des régions de chromatine accessibles en utilisant peu de cellules.
- La mise en œuvre chez C. elegans est difficile en raison de la cuticule collagénique robuste de l'organisme.
Objectif de l'étude
- Développer et présenter un protocole optimisé de séquençage ATAC pour des vers C. elegans entiers.
- Permettre un profilage efficace de l'accessibilité de la chromatine au stade L4.
- Réduire les obstacles techniques liés au séquençage ATAC chez cet organisme modèle.
Méthodes utilisées
- Culture synchronisée de C. elegans au stade L4.
- Perturbation de la cuticule et dissociation enzymatique pour obtenir des suspensions cellulaires.
- Préparation de noyaux perméabilisés pour la transposition par Tn5.
- Amplification par PCR et purification de bibliothèques prêtes pour le séquençage à haut débit (NGS).
Résultats principaux
- Le protocole nécessite seulement 30 μL de culot de vers.
- L'ensemble du flux opératoire peut être réalisé en une journée.
- Génère entre 5 000 et 9 000 pics d'accessibilité de la chromatine chez la souche de référence Bristol N2.
- La méthode peut être adaptée à d'autres stades de développement ou à des populations cellulaires purifiées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
Conclusions
- Le protocole ATAC-seq optimisé permet une analyse robuste de l'accessibilité de la chromatine chez des vers C. elegans entiers.
- Il élargit les possibilités d'étudier la dynamique de la chromatine à l'échelle du génome en réponse à diverses perturbations.
- Le flux de travail simplifié réduit les obstacles techniques pour les chercheurs utilisant cet organisme modèle.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le profilage de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome chez des larves Caenorhabditis elegans L4 entières permet une interrogation directe des paysages régulateurs dans un organisme multicellulaire intact. Ce protocole ATAC-séq optimisé réduit les obstacles techniques, renforçant la confiance prédictive dans les études de régulation génique et facilitant la détection mécanistique des risques aux stades précoces de la découverte. L'adaptabilité de ce protocole accroît sa valeur pour la validation ciblée à l'échelle du portefeuille et les initiatives de génomique fonctionnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une cartographie à haute résolution des régions de chromatine accessibles pour la validation fonctionnelle de cibles.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en révélant l'activité des éléments régulateurs dans un contexte d'organisme entier.
- Permet une interrogation orientée par des hypothèses sur les réseaux régulateurs des gènes associés aux modèles de maladies.
Développement de tests et criblage
- Offre un flux de travail standardisé pour générer des données reproductibles d'accessibilité de la chromatine à partir de petits échantillons.
- Fournit des pics quantitatifs adaptés à une analyse comparative entre différentes conditions génétiques ou environnementales.
- Prépare des systèmes biologiques validés pour des criblages ultérieurs de perturbations régulatrices.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet d'évaluer la dynamique de la chromatine en réponse à des perturbations génétiques ou environnementales dans un modèle pertinent pour la maladie.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en reliant les modifications régulatrices aux résultats phénotypiques.
- Offre une plateforme pour l'identification de biomarqueurs translationnels de l'état de la chromatine lorsqu'elle est appuyée par des études complémentaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole ATAC-seq s'intègre dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles jusqu'à la recherche préclinique, permettant un profilage robuste de la chromatine chez des organismes entiers.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en cartographiant les éléments régulateurs accessibles.
- Écrans : Fournit des données reproductibles et quantitatives sur l'accessibilité de la chromatine pour le développement d'essais et l'évaluation de composés.
- Analytique : Génère des décomptes de pics et des profils à l'échelle du génome afin de comparer les états régulateurs dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Facilite l'étude des modifications de la chromatine associées à des perturbations pertinentes pour les maladies.
- Réutilisation en entreprise : Un flux de travail adaptable permet une application étendue à travers les stades de développement et les populations cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les études sur les mécanismes régulateurs et la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Simplifie le profilage de la chromatine grâce à un protocole réalisable en un jour, reproductible à grande échelle et nécessitant une quantité minimale de matériel d'entrée.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/interrompre » en fournissant des données épigénomiques solides et reproductibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des cibles et des voies adaptée au niveau de risque, fondée sur des preuves d'accessibilité de la chromatine.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des nématodes, la dissociation cellulaire et la préparation de bibliothèques de séquençage à haut débit (NGS).
- Exige un accès à une infrastructure de séquençage de nouvelle génération et à un soutien en bioinformatique pour l'analyse des données.
- La standardisation entre les équipes est essentielle pour la reproductibilité et la comparabilité entre études.
- Le protocole peut être adapté à d'autres stades de développement ou à des populations cellulaires purifiées par tri cellulaire (FACS), selon les besoins.
- Des limitations techniques peuvent survenir en fonction de la taille de l'échantillon ou de l'efficacité de la disruption de la cuticule.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Isolation and Dissociation of Caenorhabditis elegans into Single-Cell Suspension
2:47
Nuclei Isolation and Chromatin Tagmentation for ATAC Sequencing
5:25
ATAC Library Amplification and Cycle Optimization Using qPCR
6:36
Results
7:25
Conclusion
