Name: Profilage d’accessibilité par chromatine chez les larves L4 de Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez le protocole ATAC-seq optimisé pour le profilage de l'accessibilité chromatinienne chez Caenorhabditis elegans au stade larvaire L4. Cette méthode surmonte la cuticule collagénique et permet une analyse rapide en une seule journée.

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<ol><li>Poulet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+histones+in+Physarum+polycephalum+evidence+a+phylogenetic+vicinity+of+mycetozoans+to+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genom.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of histones in Physarum polycephalum evidence a phylogenetic vicinity of mycetozoans to the animal kingdom.</a> NAR Genom. Bioinform. 3 (4), lqab107(2021).</li>
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<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins, and nucleosome position.</a> Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-21.29.9 (2015).</li>
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<li>Dhillon-Richardson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+developmental+regulatory+regions%3A+Zebrafish+tissue-specific+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fishing for developmental regulatory regions: Zebrafish tissue-specific ATAC-seq.</a> Methods Mol. Biol. 2599, 271-282 (2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>250 mL, 0.22 &micro;m PES</td><td>Ultra Curz</td><td>sc-200253</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPURE XP</td><td>Nalgene</td><td>A63886</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Maplica</td><td>200100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C5670-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 20 &micro;m</td><td>Sysmex</td><td>04-0042-2315</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141-500 mg</td><td></td></tr><tr><td>Disposable gloves</td><td>Microflex</td><td>94-243</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>sigma</td><td>D0632-10G</td><td>Nocif</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol, pure</td><td>Sigma</td><td>1003661421</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>biowest</td><td>S181S-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250 G</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)</td><td>Illumina</td><td>20034211</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Syber 50 mL</td><td>Sigma</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leivobitz)</td><td>sigma</td><td>L4386-10L</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride anhydrous</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit (50 preps)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext&reg; High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma</td><td>74835-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm</td><td>Tritech</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 90 mm</td><td>Interlux</td><td>C9015-2C</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 10 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800108</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 20 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800708</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &micro;L, filter</td><td>Cellpro</td><td>800608</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541 -500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic Powder</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic, Crystal</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-01 500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>JT Baker</td><td>3624-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>sigma</td><td>L4509-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Macron</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hypochlorite</td><td>Cloralex</td><td>544394479</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated Crystal</td><td>J.T. Baker</td><td>3824-01</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter PVDF 0.22 &micro;m</td><td>Ultra Curz</td><td>Sc-358812</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503 1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage d’accessibilité par chromatine chez les larves l4 de caenorhabditis elegans

Chromatin Accessibility Profiling in Whole Caenorhabditis elegans L4 Larvae

Le contrôle qualité après l’évaluation garantit une préparation précise de la bibliothèque Pendant le protocole, il est important de porter une attention particulière à la qPCR effectuée après la marquage de la chromatine (section 9), car elle constitue une étape essentielle pour évaluer la qualité de l’ADN et la performance de l’expérience. La figure 1A montre deux courbes d’amplification ; Le gauche (moins de 15 cycles) représente un matériel de bonne qualité qui montre...

Profilage d’accessibilité par chromatine chez les larves L4 de Caenorhabditis elegans

Chromatin accessibility plays essential roles in transcription, DNA repair, and chromosome segregation. Hyper-accessible regions usually correlate with ...

Notre recherche se concentre sur la façon dont la régulation épigénétique façonne l'expression des gènes, en particulier sur la façon dont l'accessibilité de la chromatine contrôle l'activité des gènes dans différentes conditions biologiques. L'ATAC-seq chez C. elegans est limité par sa cuticule protectrice. Nos protocoles surmontent cette barrière pour permettre une analyse fiable de l'accessibilité de la chromatine.Pour commencer, obtenez une population synchrone de vers L1 et laissez-les grandir pendant 26 heures à 20 degrés Celsius. Confirmez sous le microscope que la plupart des vers sont au stade L4. Récupérez tous les vers des plaques avec du tampon M9 et transférez-les dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Lavez les vers cinq fois avec un millilitre d'eau stérile en les laissant se déposer par gravité. Ensuite, transférez le tube contenant les vers dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes pour éliminer les restes d'aliments intestinaux. Prélevez ensuite 50 microlitres du pellet de vers et placez-le dans un nouveau tube.Pour lyser les vers, ajoutez 200 microlitres de tampon SDS-DTT frais et mélangez dans un rotateur de tube pendant exactement cinq minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon d'œufs froid. Puis centrifugez sur un picofuge pour éliminer le surnageant et répétez six fois.Ensuite, ajoutez 80 microlitres de pronase fraîchement préparée. En utilisant une pipette de 200 microlitres avec des embouts filtrés, mélangez le mélange de vers et de pronase 70 fois et incubez-le à température ambiante pendant 15 minutes. Ajoutez 800 microlitres de milieu L15 à 10% de sérum bovin fœtal et centrifugez à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après l'élimination du surnageant, ajoutez un millilitre de milieu L15 à 10% de sérum bovin fœtal et centrifugez comme démontré précédemment. Une fois que le pellet est lavé trois fois, éliminez le surnageant et remettez le pellet en suspension dans 900 microlitres de milieu L15 à 10% de sérum bovin fœtal. Filtrez ensuite la suspension à l'aide d'un filtre de 20 micromètres.Centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminez le surnageant, en laissant environ 50 microlitres. Ajoutez 45 microlitres de tampon de lyse fraîchement préparé et remettez soigneusement le sample en suspension.Ajoutez ensuite soigneusement 50 microlitres de tampon de lavage sans mélanger l'échantillon. Centrifugez à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et conservez l'échantillon sur de la glace.Pendant la centrifugation, préparez le mélange TN5 par échantillon en combinant 25 microlitres de tampon TN5, 24,8 microlitres d'eau exempte de nucléase et 0,2 microlitres d'enzyme TN5. Après centrifugation, éliminez le surnageant et conservez les noyaux sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres de mélange TN5 au pellet nucléaire.Pipettez ensuite vers le haut et vers le bas sept fois pour mélanger. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sur un bloc thermique et tapotez doucement le tube toutes les 10 minutes. Après l'incubation TN5, ajoutez 300 microlitres de tampon PB et mélangez en vortex à vitesse maximale pendant 25 secondes.Transférez tout le volume du tube dans la colonne de centrifugation. Centrifugez à température ambiante pendant une minute à vitesse maximale. Ajoutez 750 microlitres de tampon PE à la colonne de centrifugation et centrifugez à nouveau.Puis jetez le surnageant avec le tube de collecte. Après une centrifugation à vide, placez la colonne dans un nouveau tube de 1,5 millilitre étiqueté. Ajoutez 10 microlitres de tampon EB à 37 degrés Celsius au centre de la colonne sans le toucher.Laissez reposer à température ambiante pendant une minute. Puis centrifugez pendant une minute à vitesse maximale à température ambiante. Répétez ensuite les étapes d'élution pour obtenir un volume final de 20 microlitres dans le tampon EB.Effectuez une PCR en temps réel pour estimer le nombre de cycles d'amplification approprié pour l'amplification de la bibliothèque ATAC. Estimez le nombre de cycles d'amplification final en sélectionnant le cycle auquel le signal d'amplification atteint 1/3 de son maximum pour chaque échantillon. Effectuez l'amplification finale de la bibliothèque ATAC et attribuez un primer inverse différent à chaque échantillon et enregistrez-le.Amplifiez chaque échantillon pour le nombre de cycles estimé pour cet échantillon. Effectuez la réaction en chaîne par polymérase présentée dans des tubes de 200 microlitres en utilisant 10 microlitres de bibliothèque d'ADN dans un volume total de réaction de 50 microlitres. Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius si le protocole est mis en pause.Après avoir purifié la bibliothèque amplifiée, effectuez une électrophorèse capillaire pour visualiser le motif de distribution des tailles des fragments. La courbe d'amplification résultant en une amplification finale de la bibliothèque estimée à moins de 15 cycles indique un matériel de bonne qualité, adapté à la poursuite. La courbe d'amplification montrant une augmentation retardée indique un matériel de mauvaise qualité et ne doit pas être poursuivie.La distribution des longueurs de fragments après amplification a montré des motifs nucléosomales à environ 150 paires de bases et 300 paires de bases dans les échantillons valides. Un motif de fragments estompé indiquait un ADN sur-fragmenté nécessitant la répétition de l'échantillon. Notre protocole permettra un profilage de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome dans des vers entiers pour comprendre comment les environnements influencent la régulation des gènes.Le défi principal consiste à équilibrer l'apport de vers et l'activité de TN5 pour éviter une tagmentation insuffisante ou excessive, assurant un profilage optimal de l'accessibilité de la chromatine. Cette approche ouvre des opportunités pour étudier la variation épigénétique à travers des isolats sauvages, des conditions environnementales et même des espèces alternatives.

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