Microdissection par capture laser du tissu hépatique de souris fixé au paraformodéhyde pour l’analyse de l’ARN
17 avril 2026
Ce protocole décrit une méthode pour isoler l’ARN à partir de régions histologiques définies de tissu hépatique de souris fixé au paraformaldéhyde et à la température optimale de coupe, en utilisant une microdissection par capture laser, permettant une analyse ciblée de l’expression génique en aval.
Nos recherches étudient principalement la physiopathologie liée aux hépatocytes dans le contexte des maladies chroniques du foie. Ce protocole permet l’isolement cellulaire dans des tranches de tissu hépatic et l’extraction d’ARN. Contrairement au FFPE, ou protocole paraformaldéhyde fixé ou CT conserve et itéré, permettant une micro-analyse précise et des échantillons de haute qualité pour une analyse OMI en aval.
Pour commencer, exposez les lames de membrane du stylo à la lumière ultraviolette pendant quatre minutes et 30 minutes. Enrobez les lames de 0,1 milligramme par millilitre de poly L lysine et laissez-les sécher à l’air libre. Scellez les bords de chaque culasse avec un support de montage neutre.
À l’aide d’un agent de décontamination RNase, essuyez toutes les surfaces accessibles du cryostat et de tous les outils. Utiliser 75 % d’éthanol. Nettoyez soigneusement le pinceau et les outils.
Maintenant, réglez la température du cryostat à moins 20 degrés Celsius et laissez-la stabiliser. Récupérez les échantillons de foie dans un stockage à moins 80 degrés Celsius. Placez les échantillons dans la chambre du cryostat pendant au moins 15 minutes pour les équilibrer.
Appliquez une couche de composé OCT de deux à trois millimètres d’épaisseur sur l’étape de l’échantillon. Ensuite, placez l’étape de l’échantillon sur une tablette libre rapide ou à l’intérieur de la chambre du cryostat pour pré-solidifier la couche composée. Après avoir appliqué une petite quantité de composé OCT sur la couche pré-solidifiée, placez le bloc de tissu équilibré horizontalement sur le composé et maintenez-le en place pendant 10 à 15 secondes.
Puis montez l’étage de l’échantillon avec le bloc de tissu attaché sur la tête de l’échantillon cryostatique. Insérez maintenant la lame délicatement entre les plaques de serrage et les plaques arrière d’un côté du cryostat. Serrez le levier de serrage pour fixer la lame.
Ajustez l’épaisseur du cryostat à 10 micromètres. Découpez le tissu en sections et montez-les directement sur les lames de membrane prétraitées à l’intérieur de la chambre du cryostat, maintenues à moins 20 degrés Celsius. Décongelez les lames à température ambiante pendant 20 minutes.
Lavez les lames trois fois avec RN ACE free PBS quatre fois de 10 secondes à chaque lavage. Ajoutez la solution filtrée d’hématoxyline de Mayer sur les sections tissulaires pendant cinq à dix secondes. Ensuite, lavez les lames trois fois avec de l’eau sans ribonucléase pendant 10 secondes à chaque lavage pour éliminer les résidus d’hématoxyline.
Évaluez la qualité de la coloration au microscope. À l’aide de papier absorbant, séchez les lames et laissez-les sécher complètement à l’air. Essuyez la surface du laboratoire avec un agent de décontamination RNase.
Allumez le contrôleur et laissez le microscope terminer l’initialisation. Faites pivoter la clé dans le sens horaire de la position éteinte à la position allumée pour déclencher le système laser. Allumez l’ordinateur et lancez le logiciel de micro-dissection par capture laser.
Puis attendre que l’initialisation soit terminée. Insérez maintenant un tube PCR stérile de 0,2 millilitre dans le dispositif de collecte. À l’aide d’une pipette, ajoutez 10 microlitres de tampon de digestion de protéase K sur le capuchon du tube PCR.
Chargez l’appareil de collecte dans le porte-échantillons du microscope. Dans la fenêtre du dispositif de collecteur de changement. Va régler le point de référence, ajuste la mise au point de l’appareil pour voir clairement le point de référence et utilise les flèches pour le centrer si nécessaire.
Chargez une section de tissu dans le porte-échantillon avec le tissu orienté vers le bas et la position de l’étiquette à droite. Sélectionnez la lentille objective 10 x et identifiez les régions d’intérêt présentant des caractéristiques pathologiques spécifiques. Naviguez jusqu’au menu laser.
Clique sur calibrer, sélectionne oui et termine l’étalonnage. Dans le panneau de contrôle laser, réglez la puissance laser à 50, l’ouverture à cinq et la vitesse à neuf. Ensuite, utilisez la barre d’outils graphique pour dessiner un cercle autour de la zone ciblée.
Sélectionnez une forme unique, appuyez sur start cut pour effectuer une micro-dissection par capture laser et positionnez le dispositif de collecte pour collecter le tissu disséqué. Pour capturer la documentation, les images, sélectionnez fichier et choisissez d’enregistrer les images à enregistrer avant et après dans le format préféré. Après avoir collecté les cellules désirées, cliquez sur décharger pour retirer le collecteur de l’étage.
Vérifiez que 10 microlitres de tampon de digestion de protéase K restent dans le bouchon et reconstituez si nécessaire. Fermez le tube et faites-le bien en vortex. Ensuite, faites tourner brièvement le tube dans une centrifugeuse.
Conservez le tube à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction de l’ARN. La section hépatique colorée à l’hématoxyline sur la lame du stylo a été visualisée au microscope avant et après la microdissection par capture laser. Les régions d’intérêt présentant une stéatose micro-vésiculaire ont été précisément collectées dans le bouchon du tube PCR A.
Préservation de la morphologie cellulaire intacte. L’acide ribonucléique total extrait d’environ 1000 et 2000 cellules isolées de microdissection par capture laser a donné respectivement 110,7 nanogrammes et 213,3 nanogrammes. Tous les échantillons ont montré une haute pureté avec des rapports d’absorption de 260 par 280 nanomètres entre 1,9 et 2,1.
L’électrophorèse en gel a révélé des bandes distinctes d’acides ribosomales ribonucléiques 28 s et 18 s. Profils de bioanalyseurs d’acide ribonucléique provenant d’aussi peu que 1000 cellules. A donné un indice d’intégrité de l’acide ribonucléique de 6,7.
Q-R-T-P-C-R pour le gène de ménage Bêta actine a donné des valeurs seuil de cycle allant de 17 à 19. L’évaluation par bioanalyseur des bibliothèques de séquençage construites à partir de 50 nanogrammes d’acide ribonucléique total a montré un pic caractéristique entre 300 et 500 paires de bases. Le séquençage ARN de ces bibliothèques a donné des données de haute qualité avec des scores Q 20 et Q 30, dépassant 90 % et un taux d’erreur faible entre les réplications.
Un point important à considérer est de prévenir l’anti-dégradation via l’arrêt du contrôle, la coloration rapide et des conditions droites lors de notre traitement. En ordonnant cette procédure, elle peut être utilisée pour la PCR en temps réel et un séquençage avec des clés de bibliothèque optimisées pour la fragmentation. Établi dans des échantillons de foie.
Ce protocole permet le profilage des sous-groupes d’hépatocytes et soutient la recherche hématologique axée sur la pathologie.
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Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
