Un protocole pour la récolte de la suspension unicellulaire sur les cornées de souris
3 avril 2026
Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de cornées entières de souris par digestion séquentielle avec collagénase A et trypsine. Cette méthode permet de produire des cellules uniques viables avec une grande intégrité ARN, les rendant compatibles avec des applications en aval telles que le séquençage à ARN monocellulaire et le cytomètrey en flux.
Ce protocole introduit principalement une méthode pour obtenir des cellules uniques de haute qualité à partir de cornées intactes de souris. Notre méthode est une cellule unique viable avec une grande intégrité ARN, ce qui les rend compatibles avec des applications en aval telles que la cellule unique sur une cellule épaisse et fine et diamètre en écoulement. Pour commencer, placez une femelle C57BL6 euthanasiée de six à huit semaines sur une table de dissection stérile.
Après avoir rincé les paupières fermées avec du PBS, utilisez des ciseaux ophtalmiques pour réaliser une incision le long du pôle postérieur du globe oculaire, puis placez soigneusement l’œil isolé dans une boîte de Petri contenant un milieu épithélial hormonal supplémentaire glacé. Après avoir rincé le globe oculaire trois fois avec 1XPBS complété à 5 % de pénicilline streptomycine, utilisez des ciseaux ophtalmiques et des pinces pour effectuer une incision du pôle postérieur vers le limbus cornéen. Détachez doucement la cornée de la sclère et de la conjonctive le long du bord limbaire, puis à l’aide de deux paires de pinces, retirez complètement le cristallin et l’iris.
Après avoir lavé le tissu cornéen trois fois dans le PBS, transférez le tissu propre dans un nouveau tube. Ajoutez un millilitre de solution de collagénase A de cinq milligrammes par millilitre, et hachez le tissu en fragments d’environ 0,5 par 0,5 millimètre à l’aide de ciseaux ophtalmologiques. Incubez le tube contenant les fragments cornéens avec une solution de collagénase A dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Inspectez le tissu toutes les 10 minutes pendant la digestion. Lorsque plus aucun gros fragment de tissu, centrifugez l’échantillon à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirez soigneusement le surnageant. Ensuite, resuspendez la pellete dans 200 microlitres de solution EDTA à 0,25 % de trypsine.
Placez le tube dans un incubateur de culture cellulaire réglé à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour digérer les fragments de tissu restants. Enfin, utilisez une pipette P1000 équipée d’une pointe large pour triturer doucement le mélange afin d’obtenir une suspension à cellule simple. Centrifugez la suspension de cellules comme démontré précédemment, puis resuspendez la pelote dans un PBS contenant 0,04 % de BSA.
En comptant les cellules cornéennes isolées à l’aide d’un hémocytomètre, il a été constaté qu’un total de 1,05 fois 10 à la puissance de cinq cellules a été obtenu à partir de huit cornées avec une viabilité cellulaire moyenne de 94,6 % et un ratio cellulaire dépassant 96,3 %, confirmant ainsi l’adéquation de la suspension pour les applications en aval. L’analyse d’immunofluorescence a montré que la suspension cellulaire comprenait 83,5 % de cellules épithéliales pan-CK positives, 13,5 % de cellules stromales positives au kératocan et environ 3 % de cellules négatives pour les deux marqueurs. L’ARN extrait de la suspension unicellulaire présentait un nombre élevé d’intégrité ARN d’environ 8,8 et un rapport d’ARN ribosomique de 28S par 18S d’environ 2,15, confirmant une excellente qualité de l’ARN.
Après avoir obtenu des cellules uniques, nous pouvons caractériser la fonction des cellules cornéennes et l’exploration des marques de surface. Cette zone est l’étude des interactions cellulaires. Un défi dans cette méthode est de séparer pratiquement la cornée des autres tissus.
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Aperçu
Cet article présente un protocole robuste permettant d'isoler des suspensions de cellules uniques de haute qualité à partir de cornées entières de souris. La méthode combine une dissection tissulaire précise avec une digestion enzymatique séquentielle, permettant ainsi la préparation de cellules uniques viables adaptées à des applications ultérieures telles que le séquençage de l'ARN au niveau de la cellule unique (scRNA-seq) et la cytométrie en flux. Le protocole fournit un nombre élevé de cellules, une excellente viabilité et préserve l'intégrité de l'ARN, facilitant ainsi une analyse détaillée de l'hétérogénéité cellulaire cornéenne.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Ophtalmologie
- Biologie cellulaire
- Analyse à l'échelle cellulaire unique
Contexte
- La cornée est la couche la plus externe de l'œil, essentielle pour la vision et l'homéostasie de la surface oculaire.
- Le séquençage de l'ARN à l'échelle de la cellule unique (scRNA-seq) nécessite des suspensions monocellulaires de haute qualité.
- Le tissu cornéen est dense et complexe, ce qui rend la dissociation cellulaire difficile.
- Les protocoles existants donnent souvent une faible viabilité cellulaire ou une mauvaise qualité d'ARN.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole fiable pour générer des suspensions de cellules individuelles à partir de cornées de souris intactes.
- Garantir une viabilité cellulaire élevée et l'intégrité de l'ARN pour les applications en aval.
- Permettre une identification et une quantification précises des principaux types cellulaires cornéens.
Méthodes utilisées
- Disséction de cornées provenant de souris C57BL6 euthanasiées.
- Digestion enzymatique séquentielle à l'aide de collagénase A et de trypsine-EDTA.
- Hachage mécanique et trituration douce pour obtenir une suspension monocellulaire.
- Évaluation de la viabilité cellulaire par coloration au bleu de trypan et comptage au compteur hématométrique.
- Coloration en immunofluorescence pour la Pancytokeratine (cellules épithéliales) et la Kératocane (cellules stromales).
- Analyse de l'intégrité de l'ARN à l'aide d'un bioanalyseur.
Résultats principaux
- Environ 1,05 × 105 cellules obtenues à partir de huit cornées.
- Viabilité cellulaire élevée (94,6 %) et proportion de cellules uniques (96,3 %).
- Composition cellulaire : 83,5 % de cellules épithéliales positives pour pan-CK, 13,5 % de cellules stromales positives pour la kératocane, environ 3 % négatives pour les deux marqueurs.
- Nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) d'environ 8,8 et rapport d'ARNr 28S/18S d'environ 2,15, indiquant une excellente qualité de l'ARN.
Conclusions
- Le protocole produit de manière fiable des suspensions monocellulaires de haute qualité à partir de cornées de souris.
- Les préparations cellulaires conviennent à des applications en aval exigeantes, notamment la séquençage ARN monocellulaire (scRNA-seq).
- Cette méthode facilite des études détaillées de la fonction cellulaire cornéenne et des interactions entre cellules.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Des suspensions monocellulaires de haute qualité provenant de cornées de souris sont essentielles pour faire progresser la recherche ophtalmologique en phase de découverte et permettre un profilage cellulaire à haute résolution. Ce protocole résout un goulot d'étranglement critique dans la préparation de cellules uniques viables et intactes au niveau de l'ARN à partir de tissus oculaires denses, ce qui influence directement la fiabilité des analyses monocellulaires en aval. Une préparation cellulaire robuste améliore la confiance prédictive dans la validation des cibles et soutient la continuité translationnelle entre les phases de découverte et préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation de l'hétérogénéité cellulaire cornéenne à une résolution unicellulaire.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en préservant la viabilité cellulaire et l'intégrité de l'ARN.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques grâce à une identification précise des types cellulaires.
- Améliore la confiance prédictive dans le choix précoce des cibles ophtalmologiques.
Développement de criblage et de tests
- Fournit des suspensions monocellulaires standardisées à haute viabilité pour le développement de tests.
- Garantit la reproductibilité et une production quantitative pour le séquençage d'ARN monocellulaire en aval.
- Prépare un matériel biologique validé pour des procédés de criblage évolutifs.
- Permet une évaluation fiable des effets de composés sur des populations cellulaires cornéennes distinctes.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie en préservant la diversité native des cellules cornéennes.
- Préserve la qualité de l'ARN pour la découverte et la validation de biomarqueurs translationnels.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque en assurant une continuité des données depuis la découverte jusqu'aux étapes précliniques.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans les études ophtalmologiques précliniques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et la recherche préclinique, permettant une transition fluide de la dissociation tissulaire à l'analyse au niveau de la cellule unique et aux études fonctionnelles ultérieures.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant un profilage unicellulaire de haute fidélité.
- Criblage : Fournit des suspensions unicellulaires reproductibles et quantitatives, prêtes à être utilisées dans des tests et pour le criblage de composés.
- Analytique : Offre des mesures robustes de viabilité cellulaire, de quantification des types cellulaires et d'intégrité de l'ARN pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Préserve la diversité cellulaire et la qualité de l'ARN afin d'aligner les biomarqueurs et valider les résultats en phase préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole standardisé adaptable à l'ensemble des programmes de recherche en ophtalmologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des préparations standardisées, reproductibles et évolutives au niveau cellulaire unique.
- Valeur stratégique : Permet des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon et améliore l'efficacité du capital dans la recherche et le développement ophtalmologiques.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des actifs en phase de découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection des tissus oculaires et en techniques de digestion enzymatique.
- Suppose un accès à des tests de viabilité cellulaire, à l'immunofluorescence et à des instruments d'analyse de l'intégrité de l'ARN.
- Exige une standardisation interéquipes pour assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Peut être adapté à d'autres types de tissus denses moyennant une optimisation du protocole.
- La précision dans la séparation des tissus est essentielle pour éviter toute contamination et garantir la pureté des échantillons.
