Test de neutralisation de la réduction de la fluorescence du virus de l’hépatite E pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants

L’objectif principal du test de neutralisation basé sur la réduction de fluorescence est de quantifier le potentiel de neutralisation d’un candidat vaccin et des anticorps contre le HEV. La nature cytopathique connue du HEV limite le test PRND. Ce protocole se concentre sur l’entraînement immuno-basé sur la PRND, afin de visualiser les cellules infectées puis de miner — Pour commencer, compter les cellules HuH-7 fraîchement séparées.

Ensuite, placez une lame de verre de qualité microscopique dans une plaque à 12 puits, et semez 0,2 million de cellules par puits dans un DMEM complet d’un millilitre complété par 10 % de FBS. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajoutez 500 microlitres de milieux sans sérum contenant 1,8 fois 10 à la puissance de quatre copies génometiques de g1-HEV purifié aux cellules ensemencées.

Incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Utilisez 500 microlitres de DPBS pour laver les cellules trois fois. Ajoutez deux millilitres de DMEM complétés par 2 % de FBS aux puits.

Incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Lavez les cellules trois fois avec des DPBS de 500 microlitres, en les incubant pendant cinq minutes à température ambiante entre chaque lavage. Ajoutez 500 microlitres à 4 % de paraformodéhyde aux cellules, puis faites-les couver à température ambiante pendant 20 minutes.

Ensuite, lavez les cellules avec du DPBS comme démontré précédemment. Après le lavage final, couve-les dans un DPBS pendant 30 minutes à température ambiante. Ajoutez 250 microlitres de solution bloqueante contenant 5 % de sérum de chèvre normal, 0,5 % d’albumine sérique bovine et 0,3 % de Triton X100 dans un DPBS.

Faites couver dans un shaker pendant une heure à température ambiante. Retirez la solution de blocage et lavez-la une fois avec des DPBS de 500 microlitres. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de solution primaire d’anticorps à une dilution de un à 500.

Incubez les cellules toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules avec du DPBS trois fois comme démontré précédemment. Ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaire à une dilution de un pour 1 000, puis incubez pendant une heure à température ambiante dans une chambre humifiée.

Effectuez le cycle de lavage et d’incubation comme démontré précédemment. Ajoutez un réactif antifondu de 10 microlitres avec du DAPI sur une lame en verre. Montez la couche de couvercle avec les cellules orientées vers le réactif tout en évitant les bulles d’air.

Scellez la gaine de couverture avec du vernis à ongles pour la préserver en vue de la visualisation par microscopie confocale. Comptez les cellules HuH-7 fraîchement divisées. Ensuite, placez une engobe de verre de qualité microscopique dans une plaque à 12 puits, et ensemencez 0,2 million de cellules dans un DMEM complet d’un millilitre par puits.

Le lendemain, préparez une dilution en série dix fois plus grande d’anticorps anti-ORF2 et d’immunoglobuline G de lapin dans un milieu sans sérum, avec une concentration initiale d’anticorps de 25 microgrammes par millilitre, et jusqu’à une dilution finale de 10 à une puissance de moins cinq. Le volume final de la dilution doit être de 100 microlitres. Ensuite, ajoutez 1,8 fois 10 à la puissance de quatre copies du génome de g1-HEV purifié à chaque dilution d’anticorps.

Incubez le mélange du virus anticorps à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Lavez les cellules avec 500 microlitres de DPBS. Ajoutez le mélange d’anticorps à la cellule.

Incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Lavez les cellules avec un tampon de 500 microlitres. Après avoir ajouté du DMEM avec 2 % de FBS, incubez pendant 72 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Traiter les cellules pour la coloration immunofluorescente comme démontré précédemment. Après avoir acquis les images de fluorescence, ouvrez le logiciel ImageJ. Sélectionnez Fichier, et ouvrez l’image.

Ensuite, sélectionnez Image, Type, et cliquez sur 8 bits pour convertir l’image RVB en format 8 bits. Ajustez le seuil en sélectionnant Image et en choisissant Ajuster, puis Seuil, en fixant le niveau inférieur à 40, et le niveau supérieur à 255. Sélectionnez Analyser, choisissez Analyser les particules, et activez Afficher les résultats, Effacer les résultats, Résumer, Exclure sur les arêtes et Composer les régions d’intérêt.

Ensuite, cliquez sur OK pour obtenir le nombre de points fluorescents. Calculez le pourcentage de neutralisation et NT50 comme antilog de Log10 NT50, en utilisant la formule fournie. Tracez le graphique montrant la moyenne et l’écart-type de tous les champs.

Un niveau significatif d’acide ribonucléique g1-HEV a été détecté dans les cellules infectées par rapport aux cellules infectées simulées. Un test d’immunofluorescence utilisant l’anticorps anti-ORF2 a confirmé l’expression d’ORF2 dans les cellules HuH-7 infectées. Le titre de neutralisation à 50 % de l’anticorps anti-ORF2 était estimé à 2,1 fois 10 pour une puissance de trois.

Des images représentatives montrent l’apparition de cellules HuH-7 infectées par des faux et infectées par le g1-HEV dans le test de neutralisation par réduction de fluorescence. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier le potentiel de neutralisation des anticorps anti-HEV et de mesurer leur titre de neutralisation à 50 %. L’étape cruciale de ce protocole est l’isolement du virus de l’hépatite E infectieuse ainsi que la coloration cellulaire appropriée ainsi que l’acquisition d’images haute résolution.

Des méthodes alternatives telles que la RT-qPCR et l’ELISA peuvent être utilisées pour déterminer le titre de neutralisation, mais elles présentent certaines limitations.