Name: Électrophysiologie à canal unique à laide dun système miniaturisé de bicouche lipidique planaire Montal-Mueller pour lenregistrement dun canal K2P synthétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez l'électrophysiologie à canal unique avec une bicouche lipidique planaire miniaturisée Montal-Mueller. Cette méthode permet d'étudier le canal K2P ancTREK1 avec une consommation réduite de réactifs.

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Nous remercions Sofia Diletta Guzzeloni pour son aide lors de la procédure de transfection cellulaire. Nous sommes reconnaissants aux employés d'Elements, le Dr Leon Juarez et le Dr Michelangelo Paci. Ce travail a été soutenu par le Département de Médecine Moléculaire de l'Université de Pavie, en Italie, dans le cadre de l'initiative Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), par la Fondation Cariplo (#2019-1809) et par le programme de recherche PNRR CN00000013 « National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing » attribué à M.L.

F.T. et A.P. sont respectivement PDG et employé d'Elements S.r.l. Tous les autres auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Dans cette étude, nous avons utilisé la technique PLB pour évaluer les propriétés électrophysiologiques d'un canal K2P synthétique au niveau de la molécule unique. Parmi les divers modèles lipidiques plans décrits dans la littérature scientifique, nous nous sommes concentrés sur la formation de membranes lipidiques bilamellaires (BLM), qui sont formées par étalage sur une ouverture de diamètre compris entre 50 et 140 µm, percée dans une surface verticale non polaire séparant deux compartiments aqueux. Cette configuration permet de simuler l'environnement de la membrane cellulaire tout en conservant le contrôle des paramètres expérimentaux, notamment la préparation de la membrane lipidique et la composition de l'électrolyte (par exemple, la force ionique et le pH)3. Nous avons reconstitué les BLM selon la méthode de Montal–Mueller (méthode dite de « folding »)5, dans laquelle la membrane s'assemble spontanément lorsque deux monocouches lipidiques, préalablement étendues à l'interface air–eau des deux solutions aqueuses, se rejoignent au-dessus de l'ouverture par élévation du niveau d'eau.
Le protocole présenté ici pour la formation de la membrane est très intuitif ; toutefois, plusieurs étapes critiques influencent fortement la réussite expérimentale. Pour assurer une connexion électrique correcte entre le BLMchipMM et l'amplificateur, il est essentiel d'éviter la chloration des extrémités du fil Ag/AgCl insérées dans les connecteurs du circuit imprimé. Lors du montage du BLMchipMM, un positionnement incorrect des fils peut entraîner un contact avec le boîtier de l'amplificateur, provoquant des courts-circuits et une saturation du signal. La procédure de prétraitement de l'ouverture constitue un autre facteur critique : une pression excessive lors de l'application de la solution de prétraitement peut endommager la septum en polyimide, tandis qu'une manipulation inadéquate de la solution électrolytique—en particulier l'imbibition de la zone de l'ouverture—peut compromettre la formation de la membrane. En outre, un nettoyage soigneux de la chambre d'enregistrement du BLMchipMM est essentiel pour assurer la reproductibilité. L'utilisation d'alcool isopropylique à 100 %, suivie d'un rinçage complet et d'un séchage total, garantit que les résidus n'interfèrent pas avec les expériences ultérieures.
Plusieurs modifications du protocole sont possibles. Bien que la chlorination par trempage dans l’eau de Javel représente une méthode pratique et largement utilisée, d'autres approches telles que le placage électrolytique peuvent également être employées43. De même, des variations concernant le prétraitement et la préparation des lipides sont envisageables. Les solutions de prétraitement standard se composent généralement d’alcanes à chaîne longue dissous dans des solvants hydrocarbonés volatils36 ; bien qu'une solution de 1 % d’hexadécane dans l’hexane soit couramment utilisée, d'autres solvants peuvent convenir. La composition lipidique peut également être adaptée selon les besoins expérimentaux. Bien que les lipides DPhPC offrent une stabilité membranaire optimale, d'autres mélanges lipidiques, y compris des compositions naturelles ou synthétiques, peuvent être utilisés36. Un avantage majeur des bicouches lipidiques verticales formées par la méthode de repliement réside dans la possibilité de générer des membranes asymétriques, dans lesquelles chaque feuillet est constitué d’espèces lipidiques différentes5,22, une caractéristique connue pour influencer la fonction des protéines membranaires.
Le dépannage de la formation de la membrane implique généralement des ajustements des niveaux de la phase aqueuse. Si la formation de la membrane ne se produit pas initialement, abaisser et relever à plusieurs reprises le niveau du tampon dans un compartiment peut faciliter l'assemblage de la bicouche. En cas d'échec, appliquer une bulle d'air au-dessus de l'ouverture peut favoriser la redistribution des lipides et la formation de la membrane. Un échec persistant indique généralement des problèmes liés au prétraitement ou à une contamination, auquel cas il est recommandé de nettoyer la chambre d'enregistrement et de recommencer l'expérience.
Les composants principaux de ce dispositif comprennent l'amplificateur compact eNPR 100 kHz et la BLMchipMM. L'amplificateur est un système compact de voltage-clamp à faible bruit qui élimine la nécessité d'utiliser des dispositifs externes supplémentaires, tels que des cages de Faraday externes, car le boîtier de l'amplificateur lui-même assure un blindage électromagnétique efficace. La BLMchipMM est une chambre d'enregistrement miniaturisée préassemblée, intégrée à un circuit imprimé (PCB) permettant une connexion directe à l'amplificateur. Elle se compose de deux compartiments en forme de C séparés par un septum en polyimide comportant une ouverture conique réalisée au laser, là où la membrane artificielle est formée. Les dimensions réduites du système, avec des volumes de compartiment d'environ 110 µL, diminuent considérablement la consommation de réactifs et réduisent la capacité intrinsèque, améliorant ainsi la qualité du signal. En outre, l'appareil peut être réutilisé plusieurs fois sans démontage, à condition de suivre des procédures de nettoyage appropriées, ce qui réduit la variabilité et améliore la reproductibilité expérimentale.
Malgré ces avantages, certaines limitations doivent être prises en compte. La configuration actuelle ne comprend pas de modules intégrés pour le contrôle de la température, de la pression ou de la perfusion. On a signalé que la tension membranaire intrinsèque pouvait influencer les canaux mécanosensibles tels que TREK144,45,46 ; toutefois, la configuration actuelle ne permet pas une manipulation contrôlée de la tension membranaire, et aucune conclusion mécanistique n'est tirée ici. Dans l'ensemble, cette plateforme offre un système robuste et accessible pour l'enregistrement de l'activité des canaux ioniques dans des membranes artificielles. Dans cette étude, nous avons examiné le canal K2P synthétique ancTREK1, un canal ancestral dérivé par calcul informatique appartenant à la sous-famille TREK. Les données enregistrées démontrent que ancTREK1 purifié, réinséré dans des bicouches lipidiques planaires (PLB), présente un comportement unitaire conforme aux propriétés de conductance rapportées pour les canaux de type TREK1. Dans des conditions symétriques de potassium à 200 mM sans Mg2+, le canal présente une relation courant-tension (I–V) mesurable, avec des amplitudes d'environ 13 pA à 80 mV et −19 pA à −80 mV. De plus, ancTREK1 montre le mode de grande conductance caractéristique observé dans les canaux TREK1, avec une conductance plus élevée aux potentiels négatifs (~205,6 pS) par rapport aux potentiels positifs (~112,8 pS). Notamment, ancTREK1 présente un NPo accru aux potentiels positifs (0,78 à 80 mV) et un NPo réduit aux potentiels négatifs (0,53 à −80 mV et 0,28 à −120 mV), ce qui diffère des observations réalisées en configuration de patch excisé42. Ces résultats soutiennent l'utilisation de ce système pour la démonstration de principe de l'enregistrement unitaire de protéines membranaires réconstituées.

La reconstitution de canaux ioniques dans des membranes bicouches lipidiques artificielles, également appelées membranes lipidiques noires (BLM), constitue l'une des techniques établies pour réaliser la caractérisation électrophysiologique des canaux ioniques au niveau de la molécule unique1. Les avantages des BLM proviennent de leur structure. En effet, une bicouche lipidique plane (PLB) est formée au sein d'un pore présent dans une surface non polaire, séparant deux solutions liquides. Ainsi, en imitant une membrane biologique, elle permet l'enregistrement de l'activité des canaux ioniques dans des conditions hautement contrôlées, notamment en ce qui concerne la composition lipidique de la membrane ou les concentrations en électrolytes ou en composés chimiques, tout en restant accessible des deux côtés. Cette accessibilité permet également d'insérer directement les canaux ioniques, par exemple à partir d'une solution micellaire ou par fusion induite par des liposomes2,3.
Le premier système de membrane artificielle décrit a été créé à l’aide de la technique par peinture4, où une goutte de lipides dissous dans un solvant organique non volatil est appliquée sur une petite ouverture à l’aide d’un pinceau. L’ajout d’une solution aqueuse des deux côtés de l’ouverture conduit ensuite à la formation spontanée d’un double couche lipidique. Toutefois, un inconvénient majeur de cette méthode est la rétention de traces de solvant, qui peuvent affecter les propriétés de la membrane. Pour réduire la quantité de solvant organique résiduel dans les bicouches lipidiques, la méthode par repliement5 a été développée, permettant la formation de membranes lipidiques bimoléculaires (BLM) « sans solvant ». Dans cette approche, une solution lipidique dans un solvant volatil est étalée à la surface de l’eau pour former deux monocouches, puis, en élevant progressivement le niveau de la phase aqueuse au-dessus de l’ouverture, ces monocouches lipidiques se replient sur l’ouverture pour former une bicouche. Toutefois, bien que la BLM obtenue soit qualifiée de sans solvant, la formation réussie de la bicouche nécessite un prétraitement de l’ouverture par une fine couche de solvant non volatil. L’élément central requis pour ces expériences consiste en une chambre d’enregistrement comportant deux compartiments aqueux (généralement appelés cis et trans) séparés par un septum lipophile percé d’une petite ouverture (de 50 à 250 µm de diamètre) (Figure 1). Des électrodes en argent/chlorure d’argent (Ag/AgCl) sont insérées dans chacun des compartiments. Une fois immergées dans la solution électrolytique, ces électrodes établissent la connexion électrochimique entre la bicouche lipidique et l’appareil d’enregistrement. Ce dernier comprend un amplificateur en régime de potentiel imposé, qui permet un contrôle précis du potentiel transmembranaire et la mesure simultanée des courants ioniques traversant les protéines formant des pores intégrées dans la membrane.
<img alt="Schéma d'un canal ionique dans une bicouche lipidique ; dispositif d'électrophysiologie ; analyse des états fermé/ouvert du canal." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Schéma du dispositif d'électrophysiologie en bicouche lipidique planaire (BLP). Schéma des composants essentiels nécessaires aux expériences de BLP. La chambre d'enregistrement est constituée de deux compartiments aqueux (cis et trans) séparés par un septum lipophile contenant une ouverture où une bicouche lipidique est formée. Des électrodes en argent/chlorure d'argent (Ag/AgCl) sont immergées dans la solution électrolytique de chaque compartiment. L'une des électrodes applique des stimuli de tension (par exemple, des formes d'onde sinusoïdales, carrées ou triangulaires), tandis que l'autre, mise à la masse, est reliée à un convertisseur courant-tension qui transforme le courant ionique en un signal de tension proportionnel. Ce signal est amplifié, éventuellement filtré, numérisé et enregistré pour une surveillance et une analyse en temps réel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
D'autres méthodes ont également été mises au point pour former des BLM. Parmi celles-ci, une approche courante consiste à créer des bicouches lipidiques suspendues à l'extrémité d'une pipette de patch-clamp. Ainsi, la méthode d'immersion de l'extrémité6 permet la formation d'une bicouche lipidique sans solvant suspendue sur l'ouverture d'une micropipette en verre d'un diamètre d'environ 4 µm, en plongeant répétitivement l'extrémité à travers une monocouche lipidique à l'interface air-eau, capturant ainsi une monocouche unique à chaque passage. La technique de patch-clamp a également été utilisée pour des mesures unitaires dans des bicouches lipidiques. Par exemple, dans la méthode d'excision7, une pipette en verre de diamètre compris entre 10 et 80 µm est utilisée pour sceller une grande membrane initialement déposée sur une ouverture dans une chambre d'enregistrement. Alternativement, la méthode de patch à partir de liposomes implique l'utilisation d'une vésicule préformée de taille nano- à microscopique comme BLM sans solvant8,9. En particulier, les vésicules unilamellaires géantes ont été largement utilisées pour des enregistrements unitaires selon différentes configurations de patch-clamp, notamment en mode attaché à la cellule et en mode patch excisé10,11.
Plusieurs plates-formes ont également émergé pour la formation parallèle et automatisée de plusieurs bicouches. L'une de ces approches est la technique de la bicouche d'interface entre gouttelettes (DIB, pour « droplet interface bilayer »)12, dans laquelle des gouttelettes aqueuses sont placées dans un mélange lipide-solvant. Dans cette méthode, des monocouches lipidiques s'assemblent spontanément autour des gouttelettes, et la formation d'une bicouche se produit lorsque deux gouttelettes entrent en contact. Dans certains dispositifs, les DIB peuvent être formés sur des hydrogels afin d'améliorer la stabilité de la membrane13. Une approche alternative, basée sur la formation de DIB à l'extrémité d'une pipette en verre, est la méthode de la bicouche à bulles de contact (CBB, pour « contact bubble bilayer »)14, où des bulles aqueuses sont introduites dans une phase huileuse à l'aide de deux micropipettes. Comme dans l'approche DIB, une bicouche lipidique se forme spontanément lorsque deux bulles recouvertes de lipides sont mises en contact. Une autre plate-forme est constituée des systèmes de BLM en réseau, qui comprennent des réseaux de pores bien définis, à l'échelle microscopique à nanoscopique, disposés selon un motif en grille. Dans ces systèmes, des bicouches lipidiques suspendues peuvent être formées manuellement — par des techniques de peinture ou de repliement, ou par rupture de vésicules liposomales15,16,17 — ou automatiquement par injection séquentielle de solutions lipidiques et tampon lorsqu'ils sont couplés à des structures de canaux microfluidiques18,19.
Bien que de nombreuses méthodes aient été développées pour former des membranes lipidiques bimoléculaires (BLM) sans solvant, cette étude se concentre sur la méthode de pliage mise en œuvre dans une plateforme miniaturisée et intégrée afin d'analyser le comportement de canaux uniques de protéines membranaires intégrées dans une bicouche lipidique artificielle. Les expériences ont été réalisées à l'aide du dispositif Elements, composé de deux éléments : l'amplificateur Nanopore Reader Elements (eNPR) et la puce BLMchipMM (Figure 2A et Figure 2B). Le premier est un amplificateur compact à faible bruit, fonctionnant en régime de potentiel imposé, qui simplifie l'espace de travail en constituant une unité complète et indépendante, éliminant ainsi la nécessité de dispositifs externes supplémentaires. La BLMchipMM est un système préassemblé et miniaturisé conçu pour la technique de Montal–Mueller et servant d'interface expérimentale. Elle comprend une chambre d'enregistrement en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) transparent intégrée à une carte de circuit imprimé (PCB), qui comporte deux douilles destinées à accueillir des fils Ag/AgCl agissant comme électrodes pour une connexion directe à l'amplificateur. La structure centrale de la chambre est constituée d'un septum en polyimide scellé entre deux composants PMMA transparents. Le septum a une épaisseur de 50 µm, sauf dans une petite région centrale (3,78 mm2), où son épaisseur est réduite à 25 µm afin de faciliter la formation de la bicouche. Au centre de cette zone plus mince, une ouverture conique est réalisée par perçage laser, ce qui améliore la stabilité mécanique de la bicouche lipidique20,21. Quatre diamètres d'ouverture sont disponibles (50, 75, 100 et 140 µm), permettant d'ajuster la capacité membranaire (Tableau 1). Chaque composant PMMA présente une cavité en forme de C d'un volume de 110 µL, formant deux compartiments fluidiques de part et d'autre du septum en polyimide pour contenir la solution électrolytique. Deux canaux fluidiques inclinés sont percés dans chaque bloc PMMA, sur des côtés opposés : l'un sert à insérer l'électrode Ag/AgCl, tandis que l'autre permet d'ajuster manuellement le niveau de tampon dans le réservoir à l'aide d'une pipette.
<img alt="Dispositif microfluidique à compartiment modulaire ; schéma montrant le côté PMMA, les électrodes, la carte de circuit imprimé (PCB) pour l'analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Système intégré Elements Nanopore Reader et BLMchipMM. (A) Photographie montrant le BLMchipMM inséré dans la fente dédiée de l'amplificateur Elements Nanopore Reader (eNPR). (B) Représentation schématique des composants du BLMchipMM, incluant la chambre d'enregistrement en polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le septum en polyimide contenant l'ouverture de taille microscopique, et la carte de circuit imprimé (PCB) équipée de douilles pour les électrodes Ag/AgCl et d'une fente pour l'alignement de la chambre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diamètre du trou (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Épaisseur du trou (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capacité typique de la membrane (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Caractéristiques des formats d'ouverture disponibles pour le BLMchipMM. Diamètre des trous, épaisseur de la septum dans la région de l'ouverture et valeurs typiques de la capacité membranaire pour les dispositifs BLMchipMM avec des ouvertures de 50, 75, 100 et 140 µm. Les valeurs de capacité membranaire sont indiquées pour les bicouches formées à partir de lipides 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine.
Généralement, les chambres d'enregistrement utilisées en laboratoire sont soit des dispositifs fabriqués en interne, soit des appareils disponibles commercialement. Dans le premier cas, la construction du système implique l'assemblage de divers composants et le développement d'une méthode fiable pour créer l'ouverture dans le septum, ce qui peut limiter l'accessibilité pour de nombreux laboratoires. Même lorsqu'on utilise des dispositifs commerciaux, il est souvent nécessaire d'intégrer manuellement plusieurs composants avant chaque expérience. En revanche, le BLMchipMM est préassemblé et ne nécessite pas de démontage entre les expériences pour les procédures de nettoyage courantes. La même unité peut être lavée et réutilisée pour plusieurs expériences sans compromettre la qualité de la formation de la membrane, à condition que les solvants utilisés soient compatibles avec les matériaux du dispositif. Cela réduit la variabilité dépendant de l'utilisateur et minimise le risque de fuite associé aux éléments d'étanchéité manuels. L'utilisation d'électrodes en fil d'argent externes, remplaçables et réutilisables prolonge davantage la durée de vie du système, en particulier dans des conditions expérimentales qui accélèrent la consommation des électrodes.
De plus, les dispositifs fabriqués maison comportent souvent des compartiments de grand volume, ce qui augmente la quantité de composants biologiques et chimiques nécessaires aux expériences. En revanche, la miniaturisation du BLMchipMM permet de réduire au minimum les volumes expérimentaux, réduisant ainsi significativement la consommation de réactifs, de protéines et d'autres composés. Cela est particulièrement avantageux lorsqu'on travaille avec des protéines membranaires difficiles à exprimer ou à rendement faible, ou lorsque le coût élevé de la synthèse des composés testés augmente le coût global des expériences. Importamment, le BLMchipMM permet la formation de bicouches avec un minimum de solvant et supporte des configurations membranaires asymétriques, où chaque feuillet peut être composé d'espèces lipidiques différentes5,22, facilitant ainsi l'étude de la fonction des protéines membranaires dans des conditions contrôlées.
Traditionnellement, les mesures de courant sont effectuées à l'aide d'amplificateurs conçus pour les expériences de patch-clamp, qui nécessitent souvent une connexion à un numériseur séparé pour l'acquisition des données et la commande via des interfaces graphiques. Ces systèmes sont non seulement encombrants et coûteux, mais impliquent également fréquemment des procédures de configuration peu intuitives pour les utilisateurs non spécialisés. De plus, en raison de la taille de la chambre d'enregistrement et de la conception des amplificateurs standards — qui manquent généralement d'un blindage intégré pour protéger l'entrée du préamplificateur contre les interférences électrostatiques — l'utilisation d'une cage de Faraday externe est souvent nécessaire. La qualité et la mise à la terre d'une telle cage peuvent influencer considérablement le bruit du système. Le BLMchipMM, utilisé avec un amplificateur intégré compact, simplifie cette configuration en réduisant le besoin de composants externes. La numérisation du signal s'effectue à l'intérieur du dispositif, et le boîtier du système assure un blindage qui diminue la sensibilité aux interférences électromagnétiques ambiantes.
Afin de démontrer l'applicabilité de cette plateforme, le canal de type K2P ancTREK1, un membre ancestral de la sous-famille TREK déduit par analyse informatique (Figure supplémentaire 1), a été utilisé comme protéine témoin pour valider la reconstitution réussie et l'enregistrement unitaire de canaux. Les canaux K2P forment des canaux de fuite au potassium dimériques qui régulent le potentiel de membrane au repos et l'excitabilité cellulaire, les canaux TREK représentant une sous-famille bien caractérisée.

<table><tbody><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Formation de bicouches lipidiques artificielles</td></tr><tr><td>2-Propanol (&amp;ge;99,5 %)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>Nettoyage du dispositif BLMchipMM</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Préparation de gels d'agarose</td></tr><tr><td>Système d'électrophorèse horizontale sur gel d'agarose</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>Séparation des fragments d'ADN</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Sélection des bactéries transformées</td></tr><tr><td>Résine Sepharose au nanocorps anti-GFP (fabriquée en laboratoire)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Purification par affinité des protéines marquées GFP</td></tr><tr><td>Anza phosphatase alcaline</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Déphosphorylation du vecteur</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Digestion par enzyme de restriction</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Digestion par enzyme de restriction</td></tr><tr><td>Anza Red Buffer (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Buffer de digestion par enzyme de restriction</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase aprotinine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Prévention de la dégradation des protéines</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Formation de culots cellulaires et préparation des échantillons</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Formation de bicouches lipidiques planes</td></tr><tr><td>Hémisuccinate de cholestérol (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Stabilisation des protéines membranaires</td></tr><tr><td>Bleu brillant de Coomassie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Coloration des protéines</td></tr><tr><td>Eau de javel ménagère</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Chloration des fils d'argent</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Réduction de la viscosité du lysat</td></tr><tr><td>Eau doublement distillée</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Préparation des tampons et solutions</td></tr><tr><td>Éthanol (pur, 99,9 %)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Nettoyage des fils Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Bromure d'éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>Coloration de l'ADN</td></tr><tr><td>Papier de verre très fin</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Élimination du revêtement Ag/AgCl des fils</td></tr><tr><td>Amplificateur eNPR 100 kHz</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Enregistrements électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Kits Gel-Out pour l'extraction de l'ADN à partir d'agarose</td><td>A&amp;amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>Purification de l'ADN</td></tr><tr><td>Marqueur d'ADN GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>Référence de taille d'ADN</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Expression de la protéine ancTREK1</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99,5 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Agent tampon</td></tr><tr><td>Hexadécane (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Prétraitement des ouvertures</td></tr><tr><td>Hexane (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Solvant lipidique</td></tr><tr><td>Colorant de charge d'ADN 5&amp;times; (fabriqué en laboratoire)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Préparation des échantillons d'ADN</td></tr><tr><td>Buffer de Laemmli SDS 6&amp;times; (réducteur, fabriqué en laboratoire)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Préparation des échantillons protéiques</td></tr><tr><td>Solution de décoloration maison</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Décoloration des gels SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Protéase HRV-3C maison</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Coupure des protéines de fusion</td></tr><tr><td>Buffer de migration SDS-PAGE maison (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Buffer d'électrophorèse SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Élution des protéines marquées His</td></tr><tr><td>Colonnes de purification par lots</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Protocoles de purification des protéines</td></tr><tr><td>Incubateur agitateur Innova44</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Préparation d'électrolytes et de tampons</td></tr><tr><td>Bouillon LB (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Culture bactérienne</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase leupeptine</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Prévention de la dégradation des protéines</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Constituant du tampon</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>Quantification de l'ADN et des protéines</td></tr><tr><td>n-Dodécyl-&amp;beta;-D-maltoside (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Solubilisation des protéines membranaires</td></tr><tr><td>Résine Ni Sepharose Haute Performance</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>Purification IMAC</td></tr><tr><td>Ordinateur portable</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Commande des instruments et acquisition des données</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima LE-80K</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Isolation des fractions membranaires</td></tr><tr><td>Pentane (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Solvant lipidique</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase pepstatine A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Prévention de la dégradation des protéines</td></tr><tr><td>Phusion GC Buffer (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>Buffer de PCR</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Amplification par PCR</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Protection des protéines pendant la lyse</td></tr><tr><td>Polyéthylènimine (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Gel préfabriqué Tris-Glycine ProteinEle (4&amp;ndash;20 %)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Séparation des protéines</td></tr><tr><td>Système d'électrophorèse sur gel SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Électrophorèse des protéines</td></tr><tr><td>Butyrate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Amplificateur d'expression protéique</td></tr><tr><td>Ligase T4 de l'ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>Ligation de l'ADN</td></tr><tr><td>Buffer de la ligase T4 de l'ADN (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Buffer de ligation</td></tr><tr><td>Cycleur thermique (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>Amplification par PCR</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Préparation de tampons</td></tr><tr><td>Agar tryptone SOYA avec lécithine et polysorbate 80</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Étalage bactérien</td></tr><tr><td>Deux fils d'argent</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Électrodes pour électrophysiologie</td></tr><tr><td>Concentrateur à ultrafiltration (coupure à 50 kDa)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Concentration des protéines</td></tr><tr><td>Vecteur d'expression pEG BacMam</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Expression protéique</td></tr><tr><td>Câble USB</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Connexion entre l'amplificateur et l'ordinateur</td></tr></tbody></table>

Électrophysiologie à canal unique à l'aide d'un système miniaturisé de bicouche lipidique planaire montal-mueller pour l'enregistrement d'un canal k2p synthétique

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

La reconstitution fonctionnelle de canaux ioniques dans des bicouches lipidiques planes offre une stratégie pour étudier l'activité des canaux au niveau de la molécule unique. Toutefois, les systèmes conventionnels de bicouche de Montal–Mueller nécessitent généralement des dispositifs expérimentaux encombrants, un assemblage manuel de la chambre et des volumes d'enregistrement relativement importants, ce qui augmente la consommation de réactifs et peut introduire des sources supplémentaires de bruit électrique dues aux câblages prolongés et aux étages d'entrée externes. Ici, nous présentons une plateforme de bicouche miniaturisée et prête à l'emploi (BLMchipMM), intégrée à un amplificateur compact, qui permet des enregistrements stables de canaux uniques avec une consommation réduite de réactifs et une manipulation simplifiée. Ce protocole décrit l'utilisation de ce système pour effectuer des mesures d'électrophysiologie sur des canaux uniques. À l'aide de ce système, nous avons reconstitué un canal K2P synthétique (ancTREK1) et l'avons utilisé comme protéine-test de principe afin de valider la reconstitution et l'enregistrement de canaux uniques. Les enregistrements de canaux uniques montrent une relation courant-tension dans des solutions symétriques de K+ sans Mg2+, avec des valeurs de conductance compatibles avec celles rapportées pour les canaux TREK1. La reconstitution réussie de ce canal de type K2P démontre l'utilité de ce système pour l'analyse de canaux uniques dans des membranes artificielles.

Caractéristiques courant-tension (I–V) des membranes PLB
La nature hydrophobe intrinsèque des membranes bicouches les rend imperméables aux espèces chargées. Toutefois, l'application d'un champ électrique externe peut induire la formation de pores transitoires de taille nanométrique, modifiant ainsi la perméabilité et la conductance membranaires33. Afin d'évaluer la qualité des bicouches artificielles formées à partir de lipides 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, la capacité, la résistance et les caractéristiques courant-tension (I–V) de la membrane ont été mesurées en l'absence de protéines insérées. Une série de paliers de tension allant de ±20 à ±200 mV (par incréments de ±20 mV) a été appliquée, et les courants transmembranaires résultants ont été enregistrés. Les données ont été échantillonnées à 5 kHz et filtrées passe-bas à 2,5 kHz.
La capacité membranaire (Cm) et la résistance membranaire (Rm) représentent des paramètres clés pour évaluer la qualité d'une bicouche. Le PLB peut être décrit par un circuit équivalent résistance-condensateur (RC), dans lequel la membrane se comporte comme un condensateur en parallèle avec une résistance34. La composante capacitive reflète la capacité de la membrane à stocker des charges, tandis que la composante résistive reflète la perméabilité aux ions. L'application d'une forme d'onde de tension triangulaire génère une réponse en courant capacitive de forme carrée, proportionnelle à la capacité membranaire selon l'équation suivante :
<img alt="Équation du courant capacitif I_c=C_m(dv/dt), illustrant l'analyse de circuits électriques." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Équation 1">    (1)
Ici, Cm est la capacité membranaire, V est la tension appliquée et t est le temps. Après la formation de la membrane, les valeurs de capacité peuvent augmenter au fil du temps en raison de l'amincissement progressif de la bicouche35. En considérant la membrane comme un condensateur plan parallèle, la capacité est liée à la surface et à l'épaisseur de la membrane selon l'équation suivante :
<img alt="Formule de la capacité avec des lipides, équation, diagramme éducatif, constante diélectrique." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Équation 2">    (2)
Ici, εlipids est la constante diélectrique du noyau lipidique (~2), ε0 est la permittivité du vide, A est la surface de la membrane et d est l'épaisseur de la membrane36,37.
La résistance membranaire a été déterminée en utilisant la loi d'Ohm33&nbsp;:
<img alt="Équation de la force électromotrice Ir=V/Rm, schéma pédagogique sur la résistance électrique." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Équation 3">    (3)
Ici, V est la tension appliquée et Rm est la résistance membranaire. En l'absence de canaux ioniques, le courant membranaire reste proche de 0 pA, ce qui correspond à des valeurs de résistance dans la gamme du gigaohm (GΩ)33.
La relation I–V présentait un comportement linéaire (ohmique) entre 0 et ±200 mV pour les dispositifs BLMchipMM à ouverture de 75 et 100 µm. Un ajustement linéaire des données a donné des valeurs de résistance membranaire de 847 ± 16 GΩ (n = 6) pour l'ouverture de 75 µm (Figure 8A, cercles) et de 980 ± 32 GΩ (n = 7) pour l'ouverture de 100 µm (Figure 8A, carrés). Les valeurs de bruit RMS, mesurées sur des segments de 3 s de l'enregistrement du courant, étaient de 3,1 ± 2 pA (n = 7) pour l'ouverture de 100 µm et de 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) pour celle de 75 µm. La stabilité de la membrane a été évaluée en mesurant la résistance à des intervalles d'environ 2 min sur une durée totale de 1 h (Figure 8B). Les membranes bien formées sont restées stables pendant plus d'une heure, ce qui est suffisant pour la plupart des expériences électrophysiologiques. Les membranes toléraient généralement des potentiels appliqués allant jusqu'à ±200 mV sans signe d'instabilité, tandis qu'une rupture survenait entre ±220 et ±300 mV selon la bicouche individuelle. Les membranes étaient considérées comme adaptées à l'insertion de protéines lorsque les valeurs de capacité se situaient entre 40 et 60 pF pour les ouvertures de 75 µm et entre 60 et 90 pF pour celles de 100 µm, avec des valeurs de courant inférieures ou égales à 0,5 pA à 100 mV.
<img alt="Graphiques tension-courant et résistance-temps, étude de puces à membrane bicouche, résultats de l'analyse des données." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 8"> 
Figure 8 : Caractérisation électrique des BLP. (A) Relations courant-tension (I–V) des bicouches formées sur des ouvertures de 75 µm et 100 µm, montrant un comportement linéaire (ohmique) entre ±200 mV. La régression linéaire fournit des valeurs de résistance membranaire de 847 ± 16 GΩ (n = 6) et 980 ± 32 GΩ (n = 7), respectivement. (B) Stabilité de la membrane évaluée en surveillant la résistance pendant 1 h à des intervalles de 2 min. Les membranes restent stables jusqu'à ±200 mV et se rompent à des tensions comprises entre ±220 et ±300 mV. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
Caractérisation initiale du comportement du canal unitaire ancTREK1
L'ancTREK1 synthétique a été purifié et réintégré dans des bicouches lipidiques planaires (PLB), et l'activité unitaire a été surveillée à l'aide de protocoles de paliers de tension allant de −120 à 120 mV par incréments de 20 mV. Les enregistrements unitaires (Figure 9A et Figure 9B) ont révélé le comportement caractéristique de clignotement des canaux K2P38. À 80 mV, l'amplitude moyenne du courant était de 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), tandis qu'à −80 mV, l'amplitude du courant augmentait à −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) (Figure 9C). La relation courant-tension (I–V) obtenue a montré des courants unitaires mesurables à la fois aux potentiels positifs et négatifs dans des conditions symétriques de potassium à 200 mM sans Mg2+ (Figure 9D). Étant donné que les amplitudes des courants ont été estimées à partir d'histogrammes de tous les points des enregistrements acquis à 5 kHz et filtrés passe-bas à 2,5 kHz, cette relation I–V est présentée comme une preuve de principe descriptive plutôt que comme une caractérisation biophysique exhaustive.
<img alt="Analyse de l'activité des canaux ioniques ; graphique des courants et des histogrammes d'amplitude à +80 mV et -80 mV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 9"> 
Figure 9 : Activité unitaire du canal ancTREK1 synthétique. (A et B) Traces représentatives de courant unitaire enregistrées respectivement à 80 mV et −80 mV. Les lignes pointillées indiquent le niveau du canal fermé. (C) Histogrammes d'amplitude cumulée pour les potentiels positifs (à gauche) et négatifs (à droite). (D) Relation courant-tension (I–V) de ancTREK1 dans des conditions symétriques de 200 mM de potassium (K+), en l'absence de cations divalents. La courbe est ajustée à l'aide d'un polynôme du quatrième ordre, et les valeurs de conductance sont dérivées de la pente à ±80 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
Bien que ancTREK1 ne possède pas de régions N-terminale et C-terminale étendues comparé aux canaux TREK1 des mammifères, il est resté fonctionnellement actif après reconstitution. Contrairement au TREK1 des mammifères, qui présente des modes de conductance élevée et faible (132 ± 5 pS et 41 ± 5 pS à des potentiels positifs, respectivement)39, ancTREK1 ne présentait que le mode de grande conductance. La conductance unitaire à des potentiels positifs était de 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5), en accord avec les valeurs rapportées pour les canaux TREK (85–130 pS dans des conditions symétriques de potassium)38,39,40,41. À des potentiels négatifs, la conductance augmentait jusqu'à 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), ce qui est conforme au comportement précédemment décrit pour TREK139. Notamment, ancTREK1 présentait une probabilité d'ouverture normalisée (NPo) plus élevée comparée aux mesures de TREK1 obtenues à l'aide de configurations de patch excisés42. La relation NPo–tension montrait une activité accrue du canal à des potentiels positifs, atteignant 0,78 ± 0,02 (n = 5) à 80 mV. En revanche, la NPo diminuait à des potentiels négatifs, avec des valeurs de 0,53 ± 0,04 à −80 mV et de 0,28 ± 0,03 à −120 mV (Figure 10).
<img alt="Résultats d'électrophysiologie des canaux ioniques, graphique de la probabilité d'ouverture normalisée (NPo) en fonction de la tension (mV), comparaison sous forme de diagramme en barres, analyse des données." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 10"> 
Figure 10 : Analyse de la dépendance au voltage de l'activité unitaire du canal ancTREK1. Probabilité d'ouverture normalisée (NPo) en fonction du potentiel membranaire (à gauche) et comparaison de la NPo à 80 mV et −80 mV (à droite), montrant une augmentation de l'ouverture du canal aux potentiels positifs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1. Séquence d'acides aminés du canal potassique (K2P) synthétique à deux pores de type ancêtre (ancTREK1). La séquence complète d'acides aminés de l'ancTREK1 utilisée pour les enregistrements électrophysiologiques. Cette séquence a été reconstruite par inférence de séquence ancestrale à partir d'un jeu de données soigneusement sélectionné de membres de la famille TREK/TRAAK, incluant des séquences orthologues récupérées des bases de données UniProt et NCBI, filtrées pour les motifs de pore conservés, alignées et analysées à l'aide de phylogénies par maximum de vraisemblance.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit l'utilisation d'un système miniaturisé de bicouche lipidique planaire de Montal–Mueller avec amplification intégrée pour effectuer des enregistrements stables de canaux unitaires. La méthode est illustrée par la reconstitution d'un canal K2P synthétique purifié afin de valider les performances du système.

Électrophysiologie à canal unique à l'aide d'un système miniaturisé de bicouche lipidique planaire Montal-Mueller pour l'enregistrement d'un canal K2P synthétique

La reconstitution fonctionnelle de canaux ioniques dans des bicouches lipidiques planaires offre une stratégie pour étudier l'activité des canaux à l'échelle de la molécule unique. ...

Notre recherche vise à comprendre le fonctionnement des canaux ioniques et des transporteurs en utilisant des techniques intégrées de biologie structurale et d'électrophysiologie. Les dispositifs conventionnels de bicouche nécessitent un équipement complexe et un montage manuel, tandis que celui-ci constitue une plateforme miniaturisée, prête à l'emploi, intégrant un amplificateur compact.Pour commencer, préparez le dispositif d’électrophysiologie en effectuant l’étalonnage de l’instrument et en préparant les électrodes en argent ou en chlorure d’argent. Insérez les extrémités non chlorées des deux fils d’argent dans les douilles du circuit imprimé (PCB). Placez les extrémités chlorées des fils dans les canaux fluidiques percés dans la pièce en polyméthacrylate de méthyle (PMMA). Faites doucement pivoter la puce de membrane lipidique noire (BLMchipMM) et fixez-la sur le PCB en insérant la dent inférieure de la chambre d’enregistrement PMMA dans la fente dédiée. Assurez-vous que les fils atteignent le fond des canaux fluidiques. Préparez 100 microlitres d’une solution d’hexadécane à 1 % en volume dans du n-hexane à 100 % pour le traitement préalable de l’ouverture du septum. Remette

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