Expériences d’immunocoloration et de pénétration de colorants pour définir les protéines de jonction septate plissée du noyau dans les épithélios embryonnaires de Drosophila

Nos recherches étudient les fonctions développementales non occlludantes des protéines de jonction septate, en se concentrant sur l’identification et la caractérisation des nouveaux composants impliqués dans la structure et les rôles biologiques. Ce protocole vise à caractériser l’organisation et la fonction d’occllusion des jonctions septates plissées dans l’épithélium ectodermique des embryons de Drosophila. Pour commencer, croisez des mouches Drosophila mâles et femelles saines des génotypes appropriés, et placez-les dans des cages de collecte d’embryons avec des assiettes de jus de pomme frais enduites de pâte de levure.

Laissez les adultes pondre des œufs fécondés sur les assiettes de jus de pomme. Retirez la plaque de la cage de collecte des œufs et faites vieillir les embryons pendant 13 à 16 heures après la ponte à 25 degrés Celsius pour atteindre le stade 16. Ensuite, fixez les embryons de stade 16 dans une solution fixative appropriée et effectuez une immunocoloration avec les anticorps désirés.

Pour de meilleurs résultats, imagez les embryons avec un microscope confocal avec un objectif d’immersion à l’huile de 40x. Après avoir focalisé l’embryon d’intérêt, réglez l’intensité et le gain du laser pour obtenir un signal fluorescent fort sans sursaturer aucun pixel en masse. Identifier les embryons de stade 16 qui n’expriment pas la protéine fluorescente verte codée par un équilibreur, en utilisant la morphologie de l’intestin moyen.

Concentrez le scan sur la glande salivaire ou l’intestin postérieur, et positionnez le Z-scan pour inclure le plus grand diamètre possible de la lumière afin de visualiser la membrane latérale complète de la cellule épithéliale. Établissez une moyenne linéaire appropriée et imagez un tissu polarisé chez au moins 20 embryons témoins et 20 embryons de Cora 4 mutants de stade 16. Enregistrez uniquement les données d’embryons où le marqueur de jonction d’adhésion est fortement localisé dans la région apicale-latérale de la membrane.

Chez les embryons de type sauvage de stade 16, on évalue l’enrichissement des protéines de jonction septate plissée le long de la région apicale de la membrane latérale près de la jonction adhésive. Notez la distribution persistante du marqueur de jonction du septate plissé tout le long de la membrane latérale du mutant. Préparez une solution de colorant fraîche en dissolvant du dextran de 10 kilodalton marqué par rhodamine à 1 milligramme par millilitre dans 0,5 molaire phosphate de sodium à pH 7,5, avec 5 millimolaires de chlorure de potassium.

À l’aide d’un extracteur d’aiguilles, tirez un tube capillaire intérieur de 1 millimètre de diamètre sur 0,5 millimètre de diamètre intérieur avec de la fibre, dans une aiguille en verre. Ensuite, chargez l’aiguille en verre dans le porte-aiguille d’un micromanipulateur et placez le micromanipulateur à côté d’un microscope inversé. Orientez l’aiguille aussi près que possible de la lame du microscope, puis abaissez-la au même plan Z que le côté de la lame.

Cassez la pointe de l’aiguille en la frappant contre le côté de la lame du microscope. Faites monter l’aiguille au-dessus du niveau de la culasse et retirez-la pour la charger. Ensuite, remplissez le tube capillaire avec un colorant en utilisant la plus petite pointe de pipette disponible.

Rechargez l’aiguille remplie dans le porte-aiguilles. Testez le flux du dextran de 10 kilodalton en injectant une petite quantité dans une goutte d’huile d’halocarbure à la surface d’une lame de microscope. À l’aide d’un cache-cache de 22 x 22 millimètres d’épaisseur numéro 2, créez une ligne en creux sur une plaque de jus de pomme.

Alignez environ 25 embryons chacun de témoins et Cora 4 mutants au stade 16 ou 17 sur l’assiette de jus de pomme. Assurez-vous que leurs extrémités postérieures s’alignent le long de la ligne et que les surfaces ventrales soient orientées vers le haut. Ensuite, appliquez un morceau de ruban double face sur un couvercle de 22 x 22 millimètres en format 2.

Touchez le ruban à la ligne de l’embryon et frottez légèrement la barre de couverture pour transférer les embryons de la plaque sur le ruban recto-verso. Ensuite, ajoutez une goutte d’huile d’halocarbone à une lame de microscope et fixez la lame de couvercle sur la lame en laissant l’action capillaire créer une liaison. Orientez la couvercle plus près du côté de la glissière en face de toute partie givrée.

Sécher les embryons pendant trois à cinq minutes dans un récipient de désiccant, puis recouvrir complètement les embryons d’huile d’halocarbone. Montez la lame avec les embryons sur le microscope inversé, les embryons étant orientés vers le haut et à l’opposé de l’objectif. Alignez le micromanipulateur de façon à ce que l’aiguille fasse face à l’extrémité postérieure des embryons à un angle aussi proche que possible de la parallèle aux embryons, et ajustez l’axe Z du micromanipulateur de sorte que la pointe de l’aiguille s’aligne avec le point médian de l’embryon le long de l’axe dorsal-ventral.

Ensuite, injectez les embryons en déplaçant rapidement la phase dans l’aiguille afin que la pointe pénètre dans l’hémocoel. Injectez environ 0,2 à 0,5 nanolitres de colorant à l’aide d’une seringue de 10-25 ou 50 millilitres. Retirez rapidement l’aiguille et déplacez l’étape vers l’embryon suivant pour l’injection de colorant.

Ensuite, ajoutez de l’huile d’halocarbone supplémentaire sur les embryons. Couvrez les embryons d’un engobe de couverture numéro 2 de 22 x 22 millimètres pour créer une couche d’huile uniforme entre les gloutis et éviter l’écrasement. Réalisez des images sur un microscope composé fluorescent ou un microscope confocal après l’injection de colorant dextran.

Au microscope confocal, on obtient une pile en Z à travers environ un quart de la profondeur de l’embryon le long de l’axe dorsal-ventral pour évaluer la lumière de la trachée. Examinez la lumière de la trachée, une glande salivaire ou l’intestin postérieur pour détecter l’accumulation de dextranes marqués. Notez le génotype et le stade de développement de chaque embryon et si le dextrane marqué s’accumule dans un organe tubulaire.

Notez les embryons dans lesquels l’espace périvitelline est fortement coloré avec du colorant, car cela peut indiquer une injection involontaire dans cet espace. Chez les embryons de type sauvage, le complémentaire macroglobulinique, ou Mcr, était uniformément localisé le long de la membrane latérale au stade 13, s’enrichit dans la région apicale de la membrane latérale au stade 14, et était fortement localisé dans la région apicale-latérale, juste basale à la jonction de l’adhérence au stade 16. La coloration corticale par anticorps a défini les jonctions septates plissées matures chez les embryons de type sauvage de stade 16, de manière similaire à la Mcr.

Chez les embryons mutants de Cora 4, Mcr n’a pas réussi à obtenir une forte localisation apicale au stade 16 et est resté réparti le long de la membrane latérale. La localisation de l’E-cadherine était similaire chez les embryons de type sauvage et de Cora 4 mutants au stade 16. Dans les embryons de type sauvage de stade 17 injectés avec du dextran de 10 kilodalton marqué à la rhodamine, le colorant entourait la trachée mais ne pénétrait pas la lumière.

Chez les embryons du mutant Cora 4 au stade 17, le contraste s’est accumulé dans la lumière de la trachée dans les 10 minutes suivant l’injection. Ce protocole permet aux chercheurs de déterminer en toute confiance si un gène code pour le noyau ou la composante accessoire des jonctions du septate plissé dans les tissus embryonnaires de Drosophila. La stadification embryonnaire est absolument cruciale lors de cette technique, car elle nécessite des embryons de stade 16.

Les jonctions septates mûrissent avec le temps jusqu’à être pleinement établies au stade 16. Nous pensons que ce protocole peut être efficacement implémenté lors d’un dépistage génétique ouvert utilisant des lignées d’interférence ARN pour identifier de nouveaux gènes de jonction septate plissée.