Name: Le test de la mammosphère révèle une tige induite par Api5 dans les lignées cellulaires épithéliales mammaires non tumorigènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez le test de mammosphère pour évaluer les propriétés de cellules souches cancéreuses dans les cellules épithéliales mammaires MCF-10A par surexpression d'Api5. Cette méthode permet d'analyser l'auto-renouvellement et l'expression des marqueurs de pluripotence.

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1. Revêtement des plaques de culture tissulaire avec Poly(2-hydroxyéthyle méthacrylate), pHEMA
<ol>
	<li>Dissoudre 1,2 g de pHEMA (poids moléculaire ̴ 300 000) dans 100 mL d’éthanol à 95 % en remuant constamment à 65 °C pour préparer une solution de pHEMA à 1,2 % ( voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Recouvrir les plaques de culture tissulaire standard avec du pHEMA en appliquant 1 mL par puits d’une plaque à 6 puits. Le volume de la solution de pHEMA peut être ajusté en fonction de la taille du vaisseau de culture tissulaire.</li>
	<li>Laissez les assiettes sécher au four à 40 °C dans des conditions stériles.</li>
	<li>Exposez les plaques à la lumière UV pendant 15 minutes, suivies de trois lavages avec le sérum tampon phosphate (DPBS) de Dulbecco, avant de les utiliser pour préparer le test de formation de la mammosphère.</li>
</ol>
2. Ensemencement des mammosphères de génération primaire
<ol>
	<li>Culture 3D des cellules MCF10A dissociées (contrôle et surexpression Api5) obtenues par dissociation des cultures 3D du jour 16 dans le milieu de croissance14. REMARQUE : Composition du milieu de croissance : DMEM à glucose élevé sans pyruvate de sodium complété avec 5 % de sérum de cheval, 10 μg/mL d’insuline, 0,5 μg/mL d’hydrocortisone, 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF), 100 ng/mL de toxine du choléra, et 200 unités/mL de pénicilline-streptomycine (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Retirez le milieu utilisé, lavez les cellules avec 1 mL de DPBS, puis ajoutez 500 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez à 37 °C dansun incubateur humidifié à 5 % de CO 2 pendant 12 à 15 minutes jusqu’à ce que toutes les cellules soient trypsinisées.</li>
	<li>Une fois toutes les cellules déplacées, ajoutez 2 mL de milieu de resuspension pour neutraliser l’activité de la trypsine et faites tourner la suspension cellulaire à 112 × g pendant 10 minutes à température ambiante. REMARQUE : Composition du milieu de resuspension : DMEM à haute teneur en glucose sans pyruvate de sodium, complétée avec 20 % de sérum de cheval, et 200 unités/mL de pénicilline-streptomycine.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans 1 mL de milieu mammosphere. Faites passer la suspension à cellules à travers une aiguille de 25 G pour obtenir une suspension à cellule simple. REMARQUE : Composition du milieu de la mammosphère : DMEM/F12 complétés avec 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), 1 × supplément de B27 sans vitamine A, et 200 unités/mL de pénicilline-streptomycine ( voir tableau des matériaux).</li>
	<li>À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules et calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour semer 0,2 × 104 cellules par puits. REMARQUE : Maintenir une faible densité de semencement afin de déterminer avec précision l’efficacité de formation de la mammosphère, minimisant ainsi l’impact de l’agrégation cellulaire. Lors de la collecte de lysats protéiques pour l’immunobloting, la densité cellulaire peut être augmentée jusqu’à 2,5 × 105 cellules par puits.</li>
	<li>Diluez le volume de suspension cellulaire requis dans 2 mL de milieu à mammosphère et semez dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Les cellules de graines tripliquent pour chaque condition.</li>
	<li>Incubez à 37 °C dansun incubateur humidifié à 5 % de CO 2 pendant 7 jours.</li>
	<li>Après sept jours de culture, comptez manuellement le nombre de mammosphères de diamètre supérieur à 50 μm dans chaque puits soit à l’aide d’un microscope équipé d’un graticule, soit en utilisant une grille de quadrants sous un microscope optique.</li>
	<li>Imagez les mammosphères à l’aide d’un appareil photo numérique monté sur un microscope optique à un grossissement de 20x.</li>
	<li>Calculez l’efficacité de formation de la mammosphère (MFE) à l’aide de la formulesuivante 5 
	 <img alt="Équation 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. Ensemencement des mammosphères de génération secondaire
<ol>
	<li>Collectez les mammosphères formées lors de la première génération dans un tube de 15 mL et centrifugez à 300 × g pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Aspirez le surnageant, laissant la pastille de mammographie derrière vous.</li>
	<li>Lavez les granulés avec du DPBS.</li>
	<li>Ajoutez 200 μL de tripsine-EDTA 0,05 % au pellet de mammosphère et incubez à 37 °C dansun incubateur humidifié à 5 % de CO 2 pendant 2 à 3 minutes. Faites passer les mammosphères dans la solution de trypsine trois fois à travers une aiguille de 25 G pour obtenir une suspension unicellulaire.</li>
	<li>Ajoutez 0,5 mL de milieu de resuspension pour neutraliser l’activité de la trypsine et faites tourner la suspension cellulaire à 112 × g pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans 0,5 mL de milieu mammosphere.</li>
	<li>À l’aide d’un hémocytomètre, comptez le nombre de cellules et calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour semer 0,2 × 104 cellules par puits. REMARQUE : Maintenir une faible densité cellulaire pour évaluer la capacité d’auto-renouvellement, minimisant ainsi l’effet de l’agrégation cellulaire.</li>
	<li>Diluez le volume de suspension cellulaire requis dans 2 mL de milieu à mammosphère et semez dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Les cellules de graines tripliquent pour chaque condition.</li>
	<li>Incubez à 37 °C dansun incubateur humidifié à 5 % de CO 2 pendant 7 jours.</li>
	<li>Après 7 jours de culture, comptez le nombre de mammosphères de diamètre supérieur à 50 μm dans chaque plaque à l’aide d’un microscope équipé d’un graticule ou d’une grille de quadrants.</li>
	<li>Imagez les mammosphères à l’aide d’un appareil photo numérique monté sur un microscope optique à un grossissement de 20x.</li>
	<li>Calculez la capacité d’auto-renouvellement à l’aide de laformule suivante 5 
	<img alt="Équation 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Western blotting pour détecter les changements des marqueurs de pluripotence lors de la surexpression d’Api5
<ol>
	<li>Collectez les mammosphères formées lors de la première génération dans un tube de 15 mL et centrifugez à 300 × g pendant 10 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Aspirez le surnageant, laissant la pastille de mammographie derrière vous.</li>
	<li>Lavez les granulés avec du DPBS.</li>
	<li>Collectez la pellete dans un tampon RIPA glacé pour obtenir le lysat protéique et effectuez l’immunoblotting selon le protocolestandard 24. REMARQUE : Composition du tampon RIPA : 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 % de Triton X-100, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de dodécyle sulfate de sodium (SDS), 1 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA), 1 mM de fluorure de phénylméthéthysulfonyle (PMSF), 10 mM de fluorure de sodium, 1 mM d’orthovanadate de sodium.</li>
	<li>Sonde les marqueurs de tige - Oct3/4, Nanog, Sox2 et Bmi1, et contrôle de charge GAPDH (voir Tableau des matériaux pour les dilutions d’anticorps).</li>
	<li>Quantifiez les niveaux de protéines en utilisant une analyse densitométrique sur ImageJ. Sélectionnez la région d’intérêt sur les images Western blot et générez un profil de densité pour chaque voie.</li>
	<li>Normaliser les densités relatives de la protéine d’intérêt par rapport à celles de GAPDH pour chaque voie. Calculez le changement de pli pour chaque protéine.</li>
	<li>Tracez le changement de pli des niveaux de protéines à l’aide de n’importe quel logiciel de tracé.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
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<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidified incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Rabbit pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Rabbit mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscope</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td></td><td></td><td>Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1.2% pHEMA in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

le test de la mammosphère révèle une tige induite par api5 dans les lignées cellulaires épithéliales mammaires non tumorigènes

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Pour évaluer l’efficacité de formation de la mammosphère dans des conditions non adhérentes, des cellules MCF10A dissociées et témoins et surexprimées par Api5 ont été ensemencées sur des plaques recouvertes de polyHEMA selon le protocole. Les cellules surexprimant Api5 ont démontré une augmentation de 1,58 fois l’efficacité moyenne de formation de la mammosphère par rapport aux témoins (Figure 1B,C). Cette augmentation démontre qu’une expression plus élevée d’Api5 augmente ...

Le test de la mammosphère révèle une tige induite par Api5 dans les lignées cellulaires épithéliales mammaires non tumorigènes

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

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Cette vidéo décrit l’isolement des cellules souches cancéreuses des lignées cellulaires du cancer du sein. Nous cultivons ces cellules souches cancéreuses pour générer des mammosphères primaires permettant d’évaluer l’auto-renouvellement et de calculer l’efficacité de formation des sphères, ce qui permet de comparer différentes densités d’ensemencement.

Génération de mammosphères primaires : une technique pour déterminer l’activité cellulaire

Une méthode pour traiter humaine matériau mammaire chirurgicale est décrite de défausse. Tissu traité, sous la forme d'organites, peuvent être conservés congelés indéfiniment ou mis en culture pour la croissance à long terme. Cette méthode permet d'examiner expérimentale de biologie cellulaire normale épithéliale humaine, et les effets des perturbations exogènes.

Traitement des mammoplastie de réduction et de tissus humains mastectomie pour Culture Cellulaire

Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s'il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

Les dosages de sphères in vitro sont couramment utilisés pour identifier les cellules souches cancéreuses. Ici, nous comparons les dosages à sphère unique et à plusieurs cellules. Les tests basés sur des cellules uniques plus laborieux ou la supplémentation en méthylcellulose donnent des résultats plus précis, tandis que les tests multicellulaires effectués en milieu liquide peuvent être fortement influencés par la densité cellulaire.

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Les dosages de mammosphère flottante peuvent étudier le sous-ensemble de cellules cancéreuses du sein de type souche qui survivent en suspension et présentent une tumorigenèse accrue lorsqu’elles sont implantées chez la souris.  Ce protocole fournit une mesure in vitro pratique de la capacité de formation de sphères, un indicateur de la tumorigenèse in vivo, tout en facilitant l’analyse du paysage transcriptionnel associé aux tiges.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Ici, nous décrivons la mise en œuvre et l'interprétation des résultats d'un essai quantitatif d'auto-renouvellement de la mammosphère in vitro.

Quantification de l'auto-renouvellement dans les cultures de la mammosphère murine

Ce protocole fournit des outils expérimentaux in vitro pour évaluer la transformation des cellules mammaires humaines. Des étapes détaillées pour le taux de prolifération cellulaire de suivi, la capacité de croissance ancre-indépendante, et la distribution des lignées cellulaires dans les cultures 3D avec la matrice de membrane de sous-sol sont décrites.

Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

Ce protocole expérimental décrit l’isolement des CSCA à partir d’échantillons de cellules et de tissus cancéreux du sein ainsi que les tests in vitro et in vivo qui peuvent être utilisés pour évaluer le phénotype et la fonction des CSBC.

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Ce protocole décrit une approche de dépistage intraductale évolutive de CRISPR permettant des études parallèles d’élimination et d’activation du gène in vivo dans la glande mammaire de la souris.

Dépistage in vivo parallèle de l’élimination et de l’activation du gène dans la glande mammaire de la souris

Découvrez le test de mammosphère pour évaluer les propriétés de cellules souches cancéreuses dans les cellules épithéliales mammaires MCF-10A par surexpression d'Api5. Cette méthode permet d'analyser l'auto-renouvellement et l'expression des marqueurs de pluripotence.

Le test de la mammosphère révèle une tige induite par Api5 dans les lignées cellulaires épithéliales mammaires non tumorigènes

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