Profilage phénotypique des phénotypes comportementaux de type parkinsonien induits par le MPTP chez les larves de poisson-zèbre basé sur une expérience comportementale

Nous présentons un protocole comportemental multiparamétrique pour profiler de manière exhaustive les phénotypes moteurs et non moteurs parkinsoniens chez les larves de poisson-zèbre. Ce protocole s’applique à la modélisation de la maladie de Parkinson, au dépistage de médicaments, à la neurotoxicité environnementale, aux études utilisant les larves de poissons. Pour commencer, portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection.

Diluez 100x la solution d’origine E3 à un ratio de 1 pour 100 avec de l’eau ultrapure pour préparer un milieu à concentration unique. Sélectionnez maintenant des poissons-zèbres adultes mâles et femelles matures sexuellement. En utilisant des bacs d’élevage avec séparateurs amovibles, effectuez une reproduction contrôlée.

À 20h00, placez les poissons-zèbres mâles et femelles dans des sections séparées des bacs de reproduction, selon un ratio de deux mâles pour trois femelles, en utilisant des séparateurs pour les séparer. Le lendemain matin à 8h00, retirez les séparateurs pour permettre l’accouplement. Récupérez les embryons une heure plus tard et lavez-les trois fois avec de l’eau propre du système.

Hébergez les embryons dans des boîtes de Petri de 100 millimètres contenant 20 millilitres de milieu E3 frais. Ensuite, incubez les embryons à 28 degrés Celsius dans un cycle de lumière de 14 heures et de 10 heures d’obscurité. Un jour après la fécondation, retirez soigneusement les embryons non fécondés, malformés et anormaux à l’aide d’une pipette de pâturage.

Aspirez lentement le milieu depuis le bord de la boîte de Petri et ajoutez un milieu embryonnaire E3 frais le long de la paroi de la boîte de Petri pour minimiser les perturbations des embryons de type sauvage. Pour le groupe traité par MPTP, utilisez une solution de MPTP à 50 micromolaires. Quatre jours après la fécondation, modifiez une pipette de pâturage de trois millilitres en coupant 10 millimètres à partir de la pointe pour créer un large calibre.

À 18h00, utilisez la pipette modifiée pour sélectionner des larves de poisson-zèbre dans chaque groupe et transférez une larve par puits dans une plaque à 96 puits. Observez chaque puits sous un stéréoscopie pour confirmer que chaque larve de poisson-zèbre semble en bonne santé. Vérifiez que les nageoires sont ouvertes et balancent régulièrement, que le corps est droit et que l’échelle de nage est gonflée.

Ensuite, nettoyez soigneusement le bas de la plaque pour éviter que la saleté n’affecte les résultats du suivi vidéo. Ensuite, transférez la plaque à 96 puits au centre vers le fond de la chambre à boîte zébra. Sélectionnez le mode de quantification dans le logiciel de suivi vidéo.

Pour la régulation du sommeil et de l’éveil, réglez le réglage de la lumière pour éteindre la lumière à 22h00 et l’allumer à 8h00. Configurez les paramètres logiciels pour que le seuil de détection soit fixé à 40, la rafale à 25, la figele à quatre, le temps total de surveillance à 52 heures, puis la taille à 60 secondes. Commencez la procédure de réveil en sommeil à 8h00 PM.To surveillez les réponses photomotrices, placez les larves cinq jours après la fécondation dans une plaque de 96 puits avec une larve par puits. Ensuite, réglez le programme de transition de la lumière de zéro à 60 secondes d’obscurité, suivi de 60 à 120 secondes de lumière constante.

Démarrez le protocole et collectez les paramètres de mouvement toutes les six secondes tout au long du test de 120 secondes. Arrêtez le protocole à 120 secondes et exportez le fichier de données. Ensuite, placez les larves dans l’obscurité totale pendant cinq minutes pour les acclimater au test suivant de lumière stroboscopique.

Réglez le programme de transition lumineuse pour livrer la lumière stroboscopique à 10 hertz pendant 60 secondes. Pour évaluer la thigmotaxie, sélectionnez deux plaques à six puits. Remplissez chaque puits avec quatre millilitres de medium E3.

Cinq jours après la fécondation, collectez les larves de poisson-zèbre du groupe sauvage et du groupe traité par MPTP et placez-les dans des plaques de puits séparées à six puits. Avant l’évaluation de la thigmotaxie, placez les plaques du puits dans la boîte zébrée pendant 15 minutes pour permettre l’acclimatation. Ensuite, utilisez la fonction de la zone de dessin pour tracer deux cercles concentriques dans chaque puits avec un rayon de cercle intérieur égal à la moitié du rayon du puits, et commencez l’évaluation.

Pour une évaluation locomotrice, transférez les larves de poisson-zèbre âgées de cinq jours du groupe sauvage et du groupe traité par MPTP dans deux plaques distinctes à 12 puits. Après une acclimatation de 15 minutes, sélectionnez le mode d’analyse en ligne de suivi et enregistrez l’activité locomotore pendant cinq minutes à l’aide du système automatisé de suivi vidéo. Pour le test de réponse au sursaut, transférez individuellement les larves de cinq jours dans deux plaques de 12 puits avec une larve par puits et deux millilitres de milieu E3.

Placez les assiettes dans la boîte à zèbres pendant une période d’acclimatation légère de cinq minutes. Lancez le logiciel ZebraLab et activez le mode d’analyse en ligne de suivi. Ouvrez l’interface de déclenchement de la lumière, puis sélectionnez, utilisez l’une des trois méthodes de déclenchement ci-dessous, et activez les stimuli améliorés.

Ensuite, réglez la méthode de départ au moment où la session commence. Dans le calendrier de transition, définissez le rythme du flash sombre. Réglez le programme pour qu’il se déclenche après 21 secondes, puis la transition de un à cinq millisecondes avec une intensité lumineuse de 100 %.

Transition de deux à 2, 890 millisecondes avec une intensité lumineuse de 100 %. Transition de trois à cinq millisecondes avec 0 % d’intensité lumineuse, puis de quatre à 100 millisecondes avec 0 % d’intensité lumineuse. Cochez la case pour la liste répétée des transitions afin d’assurer des flashs périodiques, puis lancez le protocole.

Pour le test de défi clair-obscur, transférez les larves de poisson-zèbre dans deux plaques de 24 puits avec une larve par puits et un millilitre de milieu E3. Après cinq minutes d’acclimatation dans la boîte zébrale, activez le mode d’analyse de suivi en ligne. Ensuite, configurez le programme d’éclairage pour six minutes de lumière constante, suivies de quatre minutes d’obscurité totale.

À la 10e minute, arrêtez l’enregistrement comportemental et enregistrez les données. Retirez soigneusement l’assiette de la boîte à zèbres. Après chaque expérience comportementale, pulvérisez et essuyez toutes les surfaces en contact avec le MPTP avec une solution fraîchement préparée d’hypochlorite de sodium.

Collectez les déchets liquides et solides contenant du MPTP et identifiez-les clairement comme déchets neurotoxiques dangereux. Traiter tous les matériaux contaminés avec une solution fraîchement préparée d’hypochlorite de sodium. Les larves de poisson-zèbre traitées ont montré des traces de sommeil et d’activité d’éveil perturbées par rapport au groupe sauvage.

Le temps total de sommeil a également été significativement augmenté dans le groupe traité. Le nombre de sorties de sommeil a diminué significativement dans le groupe traité tandis que la durée moyenne des sorties a augmenté. L’activité éveillée et l’activité moyenne étaient significativement altérées dans le groupe traité.

Sous une lumière constante, l’indice de congélation du groupe traité a été significativement augmenté. Elle a également augmenté de manière significative sous la stimulation à la lumière stroboscopique à 10 hertz. Les courbes de réponse photomotrice ont montré une réactivité réduite dans le groupe traité.

Les résultats de suivi ont indiqué une diminution du comportement locomoteur et exploratoire chez le groupe traité. La nage totale et la vitesse moyenne ont également été significativement réduites dans le groupe traité. Le ratio de temps de déplacement en gel était significativement plus élevé dans le groupe traité, mais le rapport de temps de déplacement rapide était nettement plus faible.

Des transitions alternées entre lumière et obscurité ont produit des pics de vitesse prononcés chez les larves de type sauvage. La distance nagée après stimulation et la vitesse maximale après stimulation ont été significativement réduites dans le groupe traité. La latence au début de la vitesse maximale du mouvement a également été significativement retardée dans le groupe traité.

Le principal défi est de minimiser les déterminants internes tout en tenant compte de la variabilité individuelle afin d’assurer une analyse comportementale précise et reproductible au niveau du poisson-zèbre. Le clustering comportemental et le profilage phénomique peuvent être appliqués pour découvrir des effets neurotoxiques subtils et obtenir des insights magnétiques plus profonds. Des études futures pourront appliquer cette plateforme au dépistage de médicaments approuvés par des risques et à l’évaluation pharmacologique dans les modèles de la maladie de Parkinson du poisson-zèbre.