Extraction des acides gras à chaîne courte à partir des excréments de souris en utilisant une méthode acide-solvant en deux phases

Ce protocole permet l’extraction d’acides gras à chaîne courte ou SCFA à partir d’échantillons fécales de souris à faible entrée pour une analyse de routine basée sur chromatographie en phase gazeuse. Les SCFA, dont l’acétate, le propionate et le butyrate, sont produits par le microbiote intestinal via la fermentation des fibres alimentaires. Ils sont largement étudiés car ils sont associés à des phénotypes comportementaux, métaboliques et physiologiques.

Cependant, quantifier les SCFA dans les échantillons fécaux reste un défi. Ces métabolites sont volatils, souvent présents à faibles niveaux, et sont mesurés dans des matrices biologiques complexes. Dans les études sur la souris, la quantité de matières fécales collectée sur chaque animal est également souvent limitée.

Les méthodes standard peuvent nécessiter la dérivé, des volumes d’échantillons relativement importants ou un équipement spécialisé. Ici, un flux de travail d’extraction en solvant acide en deux phases utilisant de l’acide chlorhydrique dilué et de l’acétate d’éthyle est présenté pour l’extraction des SCFA à partir d’échantillons fécaux de souris à faible apport, dans un format compatible avec l’analyse GC de routine. Nous commençons donc avec notre plan correct pour continuer le reste de notre protocole.

Nous avons ensuite notre boîte d’échantillons avec nos échantillons fécaux congelés correctement étiquetés. Ensuite, nous avons réglé notre pipette de 1000 microlitres à 255. Nous avons maintenant notre dilution HCl marquée.

Nous continuons à allouer de l’HCl dans chacun de nos échantillons. Maintenant, on met de l’éthanol dans notre puits de nettoyage pour nos pinces. Aujourd’hui, nous utilisons le même éthanol pour créer notre bain pour nos pilons.

Maintenant, nous recueillons nos échantillons fécaux et les mettons dans les fioles de centrifugeuse. Nous utilisons désormais nos pilons propres pour broyer chaque échantillon fécal dans leurs fioles centrifugeuses respectives. Nous prélevons nos échantillons et les appliquons au vortex pendant au moins 10 secondes ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement mélangés.

Nous apportons les échantillons mélangés à notre centrifugeuse et installons. Assurez-vous d’un bon équilibrage de la centrifugeuse. Réglez la centrifugeuse à 16 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après 10 minutes, retirez vos échantillons de la centrifugeuse. Reclassez les nouveaux flacons de centrifugeuse correspondant à vos échantillons. Réglez votre pipette de 200 microlitres à 120.

Retirez soigneusement le surnageant, en veillant à ne pas toucher la pastille. Transférez le surnageant dans vos nouvelles fioles respectives. Vous pouvez jeter la pastille.

Ajoutez une quantité égale d’acétate d’éthyle dans vos nouvelles fioles. Ramenez ces échantillons à la centrifugeuse. Réglez la centrifugeuse à 2 374 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Après 20 minutes, retirez vos échantillons. Reclassez les nouveaux flacons de centrifugeuse correspondant à vos échantillons. Remettez votre pipette à 120 microlitres.

Faites attention à ne pas toucher la couche inférieure, en ne retirant que la couche supérieure. Transférez le surnageant dans de nouveaux flacons correctement étiquetés. Transférez ces échantillons dans votre boîte à échantillons pour les stocker jusqu’à une analyse plus approfondie.

Enfin, placez une boîte d’échantillons dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Les aliquotes SCFA extraites, de 120 microlitres chacune, ont été stockées à moins 80 degrés Celsius avant la quantification par chromatographie en phase gazeuse. L’analyse quantitative a identifié huit SCFA, incluant les métabolites clés : acide acétique, acide propionique et acide butyrique comme montré dans la figure.

Pour valider l’isolation SCFA, les données de chromatographie en phase gazeuse ont été évaluées par des tests de récupération et de reproductibilité. La récupération a été évaluée en augmentant les échantillons témoins avec des concentrations connues de l’étalon interne, tandis que la reproductibilité a été vérifiée par des analyses répétées sur et sur plusieurs jours. En résumé, ce protocole fournit un flux de travail pour l’extraction de SCFA à partir d’échantillons fécaux de souris à faible entrée.

Il ne nécessite pas de dérivatisation et est compatible avec l’analyse de routine basée sur la GC. Cette méthode peut permettre la mesure de SCFA fécale dans divers modèles murins.