Évaluation fonctionnelle de la barrière épithéliale gingivale de la souris à l’aide de traçeurs fluorescents

Il s’agit d’un protocole standardisé pour évaluer quantitativement l’intégrité de la barrière épithéliale gingivale. Ce protocole est utile pour étudier les maladies dysfonctionnelles de la barrière et tester les médicaments réparateurs de barrière dans la gengive. Pour commencer, divisez les souris sauvages mâles de type C57BL/6J en trois groupes comprenant un groupe témoin non traité, un groupe parodontite induite par ligature et un groupe parodontite induite par Porphyromonas gingivalis (parodontite) induite par Porphyromonas gingivalis.

Sélectionnez des traceurs fluorescents avec des spectres non chevauchants, tels que le dextran marqué FITC et le dextran marqué rhodamine B. Pour diluer les traceurs, mélangez un gramme par litre de FD40 et RD70 dans un gel de carboxyméthylcellulose à 2 %. Conservez le mélange préparé sur de la glace.

Après avoir confirmé la profondeur anesthésiante par le réflexe pincé des orteils, utilisez un bâillon buccal pour maintenir la cavité buccale de la souris anesthésiée ouverte. Appliquez 50 microlitres du mélange traceur préparé de façon topique sur la surface gingivale labiale de la région molaire. Laissez le mélange en place pendant 30 minutes et réappliquez si vous l’avalez.

Après 30 minutes d’application du traceur, fixez la souris en position couchée sur du carton et fixez les membres avec du ruban adhésif pour immobiliser l’animal. Ensuite, ouvrez la cavité buccale de la souris euthanasiée et isolez le maxillaire. Retirez doucement les tissus environnants et rincez soigneusement l’échantillon avec du PBS.

Placez le maxillaire isolé sur une lame en verre. Ensuite, placez de la pâte à modeler des deux côtés pour stabiliser et fixer la gaine de couverture sur l’échantillon. Positionnez soigneusement le maxillaire disséqué sur le porte-échantillon conçu sur mesure pour assurer un placement stable lors de l’imagerie.

Utilisation d’un microscope à photon unique vertical équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 25X. Concentrez-vous sur la région de soutien montée sous le maxillaire et acquérez des images. Sélectionnez la région d’intérêt sur la surface buccale de la deuxième molaire du maxillaire et commencez l’imagerie rapidement.

Acquérir des images en pile Z d’une taille de pas d’un micromètre, en partant de la surface gingive jusqu’à une profondeur de 100 à 200 micromètres pour une reconstruction tridimensionnelle. Dans le logiciel, cliquez sur fichier et sélectionnez nouveau dossier pour créer un nouveau dossier pour l’ensemble de données et attribuer un nom descriptif. Dans l’onglet acquisition, réglez le format XY à 512 par 512 avec une résolution de 0,99 micromètre par pixel.

Ensuite, réglez le facteur de zoom à un. Ensuite, réglez les longueurs d’onde d’excitation à 488 nanomètres et 561 nanomètres. Configurez les fenêtres d’émission à 500 à 550 nanomètres et 570 à 620 nanomètres respectivement.

Pour la série Z et l’imagerie tridimensionnelle, sélectionnez le mode d’acquisition ND. Réglez le pas Z à un micromètre et ajustez si nécessaire. Après avoir configuré les paramètres, sélectionnez le mode live pour visualiser la zone gingivale dans des canaux de fluorescence individuels et fusionnés.

Ensuite, cliquez sur exécuter maintenant pour commencer l’acquisition d’image. Pour mesurer la perméabilité, séparez l’intensité de fluorescence de FD40 et RD70 dans différents canaux. Fusionner les tranches de l’axe Z sans soustraction de fond.

Ensuite, utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier l’intensité de fluorescence afin d’évaluer la perméabilité de la barrière épithélienne. Cliquez sur fichier et sélectionnez ouvrir pour ouvrir l’image du maxillaire dans ImageJ. Ensuite, appuyez sur image et changez le type d’image en format 8 bits pour analyse.

Cliquez sur analyser, sélectionnez des mesures de série. Ensuite, vérifiez la surface, la moyenne et la densité intégrée, et cliquez sur OK pour confirmer. Ensuite, sélectionnez le canal désiré et ajustez le seuil en cliquant sur image, en choisissant ajuster, puis en sélectionnant seuil.

Activez l’option fond foncé pour prendre en compte les fonds noirs. Cliquez sur analyser et sélectionnez les mesures de l’ensemble. Ensuite, vérifiez la valeur grise moyenne et la limite jusqu’au seuil, et confirmez en cliquant sur « ok. »

À l’aide de l’outil de sélection à main levée, tracez manuellement le contour de la région du signal fluorescent du côté du tissu gingival. Cliquez sur analyser et sélectionnez mesurer pour obtenir les valeurs d’intensité de fluorescence où la densité intégrée représente l’intensité de fluorescence. Copiez les résultats des mesures dans un tableau Excel pour les calculs et la création de graphiques.

Calculez l’intensité moyenne de fluorescence du groupe témoin dans le tableur. Divisez la valeur d’intensité de fluorescence de chaque groupe expérimental par la moyenne du groupe témoin pour obtenir l’intensité relative de fluorescence. Dans le groupe témoin, les deux traçeurs fluorescents étaient en grande partie confinés à la surface gingivale.

Dans les groupes traités par ligature et par Porphyromonas gingivalis, une extravasation significative de FD40 et RD70 dans l’épithélium gingival a été observée. L’analyse semi-quantitative a montré une intensité de fluorescence significativement accrue des groupes FD40 et RD70 dans les groupes traités par ligature et Porphyromonas gingivalis. L’imagerie 3D a révélé une distribution de fluorescence des traceurs plus étendue et diffuse autour de la vasculature gingivale dans la ligature et les groupes traités par Porphyromonas gingivalis par rapport aux témoins.

Ce protocole quantifie la perméabilité et l’intégrité de la barrière paracellulaire gingive de la souris. Ce protocole peut être combiné avec le micro-CT pour l’analyse d’images multimodale. D’autres études peuvent explorer les médicaments réparateurs de barrières et les mécanismes moléculaires dans les maladies buccales.