Méthode d’interaction ADN-ADN chromatine associée à l’ARN

Nous avons développé la méthode d’interaction ADN-ADN chromatine associée à l’ARN, ou méthode RDD, pour cartographier le contact de la chromatine organisé par des molécules d’ARN spécifiques. La RDD cartographie de manière robuste le bande de chromatine spécifique à l’ARN et les interactions à longue portée entre les ARN endogènes et exogènes. Pour commencer, resuspendez le pellet de noyaux perméabilisé dérivé des cellules doublement réticulées de Drosophila S2 dans 15 millilitres de tampon de lyse à 0,1 % FA contenant Triton X-100.

Aliquote 1,5 millilitre de la suspension nucléaire dans un tube à essai à fond rond de 14 millilitres tout en évitant la formation de bulles. Soniser la suspension à une amplitude de 38 % pendant 4,5 minutes en utilisant des cycles de 30 secondes allumée et d’arrêt de 30 secondes. Collectez la chromatine sonique dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 3 200 g pendant 20 minutes à température ambiante.

Transférez environ 13 millilitres de ce surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ajoutez maintenant 100 microlitres de billes de Streptavidine C1 préparées dans le tube contenant la chromatine sonique et faites pivoter pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, placez le tube sur un support magnétique pendant une minute et transférez le surnageant contenant la chromatine pré-dégagée dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Stockez une aliquote de 10 microlitres à moins 20 degrés Celsius pour analyse. Incubez 26 millilitres de tampon d’hybridation fraîchement préparé avec 13 millilitres de chromatine pré-dégagée sur un rotateur pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, aliquotez le mélange d’hybridation en trois tubes de 15 millilitres, et ajoutez six microlitres de sondes biotinylées à 100 micromolaires à chaque échantillon.

Après avoir scellé les bouchons des tubes avec du film, faites tourner les tubes à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir bloqué les billes de streptavidine C1, retirez le tampon de blocage et resuspendez les billes dans 400 microlitres de tampon d’hybridation. Ajoutez maintenant les billes de streptavidine C1 traitées au tampon blocant à la chromatine hybridée correspondante préparée précédemment.

Faites tourner le mélange pendant 2,5 heures à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant et transféré les billes dans un tube de 1,5 millilitre, lavez les billes cinq fois avec 800 microlitres de tampon de lavage, puis deux fois avec un tampon TE. Après le lavage final, écartez le surnageant et resuspendez les billes dans 1 000 microlitres de tampon TE contenant 1X inhibiteur de protéase à température ambiante.

Pour bloquer les sites inoccupés sur les billes de streptavidine C1 liées au complexe sonde-chromatine, ajoutez 220 microlitres d’IPB dénaturé aux billes et faites pivoter le tube à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, lavez les billes de Streptavidine C1 cinq fois à l’aide d’un tampon TE. Ensuite, ajoutez 693 microlitres de mélange de réparation finale à la chromatine sur les billes de stroptavidine C1 et mélangez bien.

Ensuite, ajoutez sept microlitres de polymérase ADN T4. Incubez le mélange sur un thermomixeur à 800 tours par minute et 12 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, incubez l’échantillon sur un mélangeur à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Lavez les billes trois fois avec 800 microlitres de tampon ChIA-PET glacé, puis une fois avec un tampon TE. Ensuite, ajoutez 693 microlitres de mélange A-tailing à la chromatine sur des billes de streptavidine C1 et mélangez bien. Ensuite, ajoutez sept microlitres du fragment de Klenow trois exonucléase prime à cinq premières moins.

Incubez le tube sur un mélangeur à 12 tours par minute et à 37 degrés Celsius pendant 50 minutes. Lavez les billes trois fois avec 800 microlitres de tampon ChIA-PET glacé, puis une fois avec un tampon d’élution en pipotant doucement. Ajoutez maintenant 1 390 microlitres de mélange de ligature de proximité à la chromatine sur des billes de streptavidine C1, puis faites éclore sur un mélangeur à température ambiante pendant cinq minutes.

Ajoutez 10 microlitres de ligase d’ADN T4 au mélange et incubez en rotation à 20 tours par minute à température ambiante pendant cinq minutes, puis passez à 12 tours par minute à température ambiante pendant 50 minutes et poursuivez l’incubation à 16 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, lavez les billes trois fois avec 800 microlitres de tampon ChIA-PET glacé, puis deux fois avec un tampon TE. Pour la libération de la chromatine, ajoutez 480 microlitres de tampon d’élution LC ChIP à la chromatine sur les billes de stroptavidine C1 et mélangez bien.

Ajoutez 20 microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K pour la désentreticulation. Incubez le tube sur un thermomixeur à 950 tours par minute et 65 degrés Celsius pendant la nuit, puis purifiez l’ADN ligaturé de proximité à l’aide d’un réactif phénol :chloroforme :isoamyl. Ajoutez tous les composants nécessaires au test de marquage Tn5 dans un volume de réaction total de 50 microlitres dans un tube PCR sur glace.

Incubez la réaction de marquage à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un thermocycleur avec le couvercle réglé à 70 degrés Celsius, puis maintenez-la à quatre degrés Celsius. Ajouter 50 microlitres de tampon d’élution ChIP et un microlitre de protéinase K à l’ADN marqué. Mélangez la solution et incubez sur un thermomixeur à 65 degrés Celsius et 900 tours par minute pendant 30 minutes.

Purifiez l’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN, puis quantifiez l’ADN à l’aide d’un système automatique d’électrophorèse capillaire. Ajoutez tout l’ADN fragmenté ligué à des billes M280 pré-bloquées avec un tampon bloqueant et de l’ADN génomique, puis mélangez la suspension. Faites tourner le tube sur un batteur à température ambiante pendant 45 minutes.

Après une brève pirouette, placez le tube sur un support magnétique et jetez le surnageant. En suivant les étapes de lavage, ajoutez 30 microlitres de tampon d’élution aux billes sans mélanger. Préparez le mélange PCR selon le kit de préparation de la bibliothèque ADN.

Transférez les tubes PCR à une machine PCR et installez le programme d’amplification. Enfin, après avoir purifié le produit PCR à l’aide de billes magnétiques, mesurez 10 à 30 nanogrammes d’ADN bibliothèque à l’aide d’un quantificateur d’acides nucléiques pour préparer l’échantillon au séquençage. Les fragments de chromatine sonique variaient d’environ 1 000 à 3 000 paires de bases, indiquant une fragmentation réussie.

La chromatine associée à l’ARN affichait une taille de fragment allant d’environ 1 000 à 3 000 paires de bases. La chromatine marquée avec Tn5 montrait une distribution de fragments indiquant l’efficacité de la marquage de la chromatine. La bibliothèque de séquençage après amplification présentait une distribution de la taille des fragments allant d’environ 180 à 1 000 paires de bases.

Après sélection de taille, les fragments de la bibliothèque de séquençage ont été principalement enrichis dans une plage d’environ 250 à 600 paires de bases. L’interaction ADN-ADN chromatine associée à l’ARN, ou méthode RDD, a détecté les emplacements génomiques de la liaison ROX2 et 7SK de l’ARN NC, ainsi que des boucles d’interaction chromatine distantes correspondantes. Les données de la polymérase ARN II ChIA-PET révèlent une relation régulatrice claire entre ces ARN NC et l’expression génique, avec des pics indiquant la force d’interaction.

L’analyse multidimensionnelle a été réalisée en intégrant des interactions ancrées dans la RDD avec des cartes de conformation de chromatine génomiques Hi-C et des marques épigénomiques, la transcription naissante et les données ChIA-PET de la polymérase ARN II. Dans ces régions, les domaines topologiquement associés étaient clairement visualisés, avec des boucles de chromatine guidées par l’ARN souvent situées à leurs limites ou s’étendant sur plusieurs de ces domaines. De plus, les centres de régulation centrés sur l’ARN ont été déterminés.

La méthode RDD et les interactions chromatine ancrées révélant les sites de liaison ARN et les interactions ADN-ADN associées dans l’organisation du génome 3D. Les enseignements clés sont le maintien des rapports appropriés entre sonde, liaison et chromatine, ainsi que le blocage des sites de streptavidine non bornés avec la biotine naturelle avant la ligation par polymérase. De futures études pourront explorer comment l’ARN enroule dynamiquement les interactions de la chromatine à travers le développement, les perturbations et les infections.