Imagerie à super-résolution et gestion partagée : un protocole pour la microscopie confocale avec détection multiplex
24 février 2026
Ce protocole détaille les applications avancées d’imagerie et la gestion des ressources partagées d’un système de microscope confocal à balayage laser intégré à un détecteur à réseau multiplexé pour l’imagerie cellulaire et subcellulaire à haute résolution. Ce flux de travail permet l’imagerie multimodale de la confocale à la super-résolution (~120 nm) sur une seule plateforme, rendant la visualisation à l’échelle nanométrique plus accessible.
Nos recherches portent sur le développement de méthodes d’imagerie à super-résolution accessibles pour visualiser des structures subcellulaires dynamiques, dépassant ainsi la limite de diffraction de la microscopie conventionnelle. La méthode à super-résolution fait face à la phototoxicité, au fonctionnement complexe et à la préparation spécialisée. Ce protocole réduit ces barrières grâce à la détection multiplex basée sur la confocale.
Pour commencer, allumez l’unité principale du microscope, le module de lancement laser, la source lumineuse LED et l’ordinateur de contrôle. Lancez le logiciel d’exploitation du microscope. Depuis l’interface principale, sélectionnez GFP, puis choisissez éteindre la lumière réfléchie.
Naviguez jusqu’au panneau Acquisition. Dans le menu déroulant des objectifs objectifs, sélectionnez l’objectif approprié. Pour l’imagerie des cellules vivantes, 45 à 60 minutes avant l’imagerie, activez la chambre environnementale et le système de stabilisation active de la mise au point.
Une fois le système stabilisé, vérifiez la stabilité à l’aide des capteurs de chambre. Appliquez de l’huile d’immersion sur l’objectif avant sans introduire de bulles. Placez l’échantillon préparé sur l’étage du microscope.
Soulevez-le doucement jusqu’à ce que la housse entre en contact avec l’huile d’immersion. Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition. Allez dans l’onglet Acquisition et sélectionnez créer une nouvelle expérience.
Maintenant, ajoutez des pistes d’imagerie pour les fluorophores utilisés. Pour chaque piste, réglez le diamètre du trou d’épingle confocal à une unité d’air. Pour optimiser la puissance du laser, sélectionnez le premier canal et passez en mode balayage en direct.
Réglez la puissance initiale du laser à une valeur basse, puis réglez le gain du détecteur à un niveau modéré dans sa plage linéaire. Ensuite, augmentez progressivement la puissance du laser jusqu’à ce que les structures cibles soient clairement visibles au-dessus de l’arrière-plan dans l’image en direct. Réglez la taille des pixels à l’aide du bouton d’échantillonnage Nyquist du logiciel pour la calculer automatiquement.
Ensuite, réglez le temps des pixels. Maintenant, sélectionnez le mode de balayage séquentiel entre les pistes pour minimiser la diaphonie. Cliquez sur Snap pour acquérir une seule image.
Sauvegardez l’image avec les métadonnées pertinentes. Pour des réglages cohérents entre les sections optiques, vérifiez que tous les paramètres d’imagerie sont configurés sur un plan focal optimal unique avant de définir la pile Z. Ouvrez l’onglet Acquisition et sélectionnez le mode Z-stack.
Définissez le volume d’intérêt en utilisant un scan en direct à vitesse rapide pour vous concentrer d’abord sur la structure la plus basse d’intérêt, puis cliquez sur Définir Dernier ou Bas. Ajustez soigneusement la mise au point vers la structure la plus haute qui vous intéresse et cliquez sur Mettre en premier ou en haut. Le logiciel affichera alors la profondeur totale.
La taille de la pile Z est réglée pour répondre au critère d’échantillonnage de Nyquist. Utilisez le bouton Optimal pour le calculer automatiquement. Après avoir configuré les paramètres d’imagerie pour chaque canal, augmentez légèrement la puissance ou le gain du laser pour les signaux faibles par rapport à une seule image bidimensionnelle.
Commencez l’acquisition pour collecter toute la pile d’images. Pour la visualisation, utilisez le module de traitement natif du microscope. Générez des projections à intensité maximale pour visualiser tous les signaux en mise au point dans une seule image bidimensionnelle.
Ensuite, effectuez un rendu volumique en utilisant les algorithmes intégrés au logiciel pour générer une représentation tridimensionnelle. Ajustez la luminosité, l’opacité et l’éclairage selon les besoins. Par la suite, on génère des sections orthogonales XZ et YZ pour inspecter l’étendue axiale et l’enregistrement.
L’imagerie à fluorescence multicolore des cellules fixes de COS-7 a montré que les noyaux, mitochondries et microtubules étaient clairement marqués avec un chevauchement minimal, confirmant un balayage séquentiel efficace et une détection optimisée. La projection d’intensité maximale intègre les signaux à travers toutes les sections optiques, mettant en lumière la distribution spatiale des structures marquées par fluorescence. Une reconstruction en trois dimensions offre une vue profonde de l’architecture de l’échantillon.
L’imagerie en accéléré de cellules hépatistes 3B vivantes avec des mitochondries marquées EGFP est comparée entre plusieurs modes. Les cadres confocaux à travers les points temporels montrent des structures claires, mais une perte progressive du signal. Les images standard en super résolution ou SR montrent une résolution plus élevée, mais un blanchissage photo accru avec le temps.
Les images en super résolution rapide ou SR-4Y préservent une fluorescence stable même à des moments ultérieurs. Le graphique de l’intensité moyenne de fluorescence de l’EGFP sur 100 points temporels montre que le mode SR-4Y maintenait le signal le plus stable. La performance d’imagerie dans les cellules fixes COS-7 a été comparée entre les modes, et les modes à super-résolution offraient un détail structurel plus clair que les confocaux.
La mesure de la fonction d’étalement ponctuel à l’aide de billes fluorescentes de 100 nanomètres a montré que la SR d’Airyscan avec déconvolution articulaire subséquente améliorait à la fois la résolution latérale et axiale par rapport à la SR d’Airyscan seule. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier la morphologie des organites, la dynamique du cytosquelette et la colocalisation des molécules dans des cellules fixes et vivantes à une résolution d’environ 120 nanomètres. La considération la plus cruciale de ce protocole est une préparation méticuleuse de l’échantillon utilisant du verre de couverture de haute qualité et une coloration optimisée pour garantir l’intégrité du signal pour un traitement à super-résolution.
En suivant cette procédure, les chercheurs peuvent effectuer une analyse quantitative d’images, comme la mesure du rapport signal/bruit ou la colocalisation, en utilisant un logiciel dédié comme ImageJ.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour des applications d'imagerie avancées utilisant un microscope confocal à balayage laser intégré à un détecteur multiplexé en réseau. Il permet une imagerie multimodale, passant du mode confocal à la super-résolution (~120 nm), rendant ainsi l'imagerie cellulaire à haute résolution plus accessible.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie
- Imagerie cellulaire
- Techniques de microscopie
Contexte
- La microscopie classique présente des limites dues à la diffraction.
- Les méthodes d'imagerie en super-résolution peuvent être complexes et phototoxiques.
- Ce protocole vise à réduire les obstacles à l'imagerie en super-résolution.
- Il met l'accent sur la détection multiplexe basée sur la microscopie confocale pour une accessibilité améliorée.
Objectif de l'étude
- Offrir un protocole détaillé pour l'imagerie haute résolution.
- Faciliter l'étude des structures cellulaires et subcellulaires.
- Améliorer l'accessibilité des techniques de super-résolution.
Méthodes utilisées
- Configuration du microscope confocal et des contrôles environnementaux.
- Réglage des paramètres d'acquisition d'image pour des résultats optimaux.
- Balayage séquentiel afin de minimiser les interférences entre les canaux.
- Acquisition et traitement des images pour la visualisation.
Résultats principaux
- Démontré une imagerie efficace des structures cellulaires avec un chevauchement minimal.
- Montré une résolution améliorée en modes super-résolution par rapport à la microscopie confocale.
- Mis en évidence l'importance d'une préparation méticuleuse des échantillons.
- Fourni des méthodes d'analyse quantitative des images.
Conclusions
- Ce protocole permet une étude détaillée de la morphologie et de la dynamique des organites.
- Il prend en charge des applications d'imagerie sur cellules fixées et cellules vivantes.
- Les chercheurs peuvent atteindre une résolution d'environ 120 nm.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La microscopie confocale super-résolutive avec détection multiplexe permet une visualisation à l'échelle nanométrique des structures subcellulaires tout en réduisant la phototoxicité et la complexité opérationnelle. Ce protocole soutient des flux de travail d'imagerie quantitative à haut contenu, essentiels à la découverte précoce, à la validation de cibles et à la réduction des risques mécanistiques en recherche et développement biopharmaceutiques.&D. La plateforme intégrée et le modèle de gestion partagé facilitent un imagerie évolutive et reproductible au sein d'équipes de recherche variées et de projets multiples.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une visualisation directe de la morphologie des organites et de la dynamique du cytosquelette avec une résolution d'environ 120 nm.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en quantifiant la colocalisation moléculaire et la distribution spatiale.
- Réduit l'ambiguïté mécanistique grâce à une imagerie à haut rapport signal/bruit des processus subcellulaires.
- Facilite la confiance prédictive dans les hypothèses biologiques en phase précoce.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage phénotypique en aval et l'évaluation de composés.
- Standardise les paramètres d'imagerie afin d'assurer la reproductibilité et la comparabilité entre études.
- Permet la détection multiplexée en fluorescence multicolore pour le développement d'essais complexes.
- Fournit des résultats quantitatifs adaptés à l'analyse d'images automatisée et aux pipelines de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats d'imagerie avec des modèles cellulaires pertinents pour les études translationnelles de biomarqueurs.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en permettant l'imagerie de cellules fixées et vivantes.
- Fournit des données ajustées aux risques pour guider les décisions d'avancement, basées sur des lectures quantitatives au niveau subcellulaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole relie la découverte précoce, le criblage et la recherche translationnelle en proposant un flux de travail d'imagerie unifié, allant de la microscopie confocale aux modes de super-résolution.
- Biologie de la découverte : Facilite le test d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par imagerie à l'échelle nanométrique des structures cellulaires.
- Dépistage : Garantit la prête-à-l'emploi et la reproductibilité des tests grâce à des protocoles d'imagerie standardisés et multiplexés.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives telles que le rapport signal-sur-bruit et la colocalisation pour une analyse robuste des données.
- Recherche translationnelle Permet l'alignement des biomarqueurs et la validation de modèles de maladies grâce à une imagerie multimodale à haute résolution.
- Réutilisation au niveau de l'entreprise : Fournit un modèle évolutif et mutualisé de ressources pour une infrastructure d'imagerie durable à travers R&Équipes D.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit les risques mécanistiques dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des flux de travail d'imagerie standardisés, reproductibles et évolutifs.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en permettant une imagerie quantitative robuste.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des programmes de découverte et précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale, en préparation d'échantillons et en analyse d'images.
- Exige un accès à des plateformes confocales multiplexées et à une infrastructure informatique pour le traitement des données.
- Implique une standardisation rigoureuse entre les équipes des paramètres d'imagerie et une gestion méticuleuse des métadonnées.
- Adaptable à des modèles cellulaires fixes et vivants, en tenant compte de la phototoxicité et de l'optimisation des colorations.
- Dépend de l'utilisation de verres de couverture de haute qualité et d'une préparation optimisée des échantillons pour atteindre une performance en super-résolution.
