Name: Isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour générer les lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Découvrez l'isolement, la culture et la transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour la recherche sur les cellules CAR. Ce protocole permet une ingénierie efficace et reproductible pour l'immunothérapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High Performance</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD staining solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Merck</td><td>A4503-10G</td><td>Pour l'isolation par écoulement de gravité</td></tr><tr><td>CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>Conjugué : PE</td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>Conjugué : APC</td></tr><tr><td>CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>Conjugué : PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>Conjugué : PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>Conjugué : PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>Conjugué : APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>Pour l'isolation par écoulement de gravité</td></tr><tr><td>CD45 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>Conjugué : VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>Conjugué : Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>Conjugué : Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>Conjugué : VioGreen</td></tr><tr><td>CD8 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>Conjugué : FITC</td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>Pour l'isolation par écoulement de gravité</td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat Ice Machine</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell Freezer Container</td><td>Corning</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>Counting chamber, B&uuml;rker-T&uuml;rk pattern, BLAUBRAND</td><td>Brand</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw cap</td><td>Sarstedt</td><td>72,380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX Flow Cytometer</td><td>Beckmann Coulter</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow cap</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 0.1&ndash;2.5 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 100&ndash;1000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 2&ndash;20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 20&ndash;200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck</td><td>E6758-100G</td><td>Pour l'isolation par écoulement de gravité</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Value FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>Pour l'isolation par gradient de densité</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Sterile Graduated Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>avec module PC et module CE</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp;PIPETBOY acu 2 pipet aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Pour l'isolation par écoulement de gravité</td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, PS, V-bottom, clear, non-binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651901</td><td></td></tr><tr><td>Mon

isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes t humains primaires pour générer les lymphocytes t du récepteur chimérique de l’antigène (car)

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

Activation et expansion des lymphocytes T humains primaires Les lymphocytes T primaires ont été décongelés et activés dès le jour 0 avec des billes CD3/28 ou du TransAct, étendus pendant 23 jours et comptabilisés tous les 2-3 jours (Figure 2A). Les jours de comptage, les densités cellulaires ont été ajustées à 0,3-0,5 x 106 cellules/mL. Les jours 0/2/5/9/14/20, les lymphocytes T ont été utilisés pour une analyse cytométrique en flux afin d’évaluer le phénotype et l’expression des marqueurs d’activation. Au cours de la première semaine après l’activation, les lymphocytes T se sont proliférés et se sont rapidement étendus avec les deux réactifs d’activation (Figure 2B), avec une expansion de repliement légèrement plus faible pour les lymphocytes T activés par TransAct (Figure 2C). Notamment, l’activation des lymphocytes T était également visible par analyse microscopique, avec des grappes de cellules T se formant autour des réactifs d’activation (Figure 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Activation et expansion des lymphocytes T primaires à l’aide de deux réactifs d’activation différents. (A) Représentation schématique de la chronologie expérimentale. Les cellules ont été activées soit avec des billes CD3/28, soit avec TransAct le jour 0 et cultivées pendant 23 jours. Les points bleus représentent les jours où les cellules ont été comptées, les points rouges les jours où les cellules ont été analysées par cytométrie en flux, et les points violets les jours où les deux analyses ont été effectuées. (B) et (C) Expansion des lymphocytes T primaires durant (B) la première semaine ou (C) dans les 16 jours suivant la culture. Les valeurs indiquent la moyenne ± l’écart-type de 4 billes (CD3/28) ou 3 donneurs de cellules T saines différents (TransAct). (D) Images microscopiques représentatives des lymphocytes T activés avec un regroupement cellulaire visible aux jours 1 et 2 après l’activation. Les images ont été prises au microscope inversé. La règle correspond à 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Coloration du phénotype des lymphocytes T et des marqueurs d’activation Pour l’analyse cytométrique en flux, la stratégie de gating suivante a été appliquée (Figure 3) : une première grille (FSC-Hauteur vs. SSC-Hauteur) a été appliquée pour éliminer les débris cellulaires et les billes, suivie d’une ouverture de portail pour les cellules individuelles (FSC-Largeur vs. SSC-Surface). Le pourcentage de cellules CD3+ devrait se situer entre 98 et 100 %. Un sous-gate supplémentaire a permis de déterminer le pourcentage de lymphocytes T CD4+ (auxiliaires) et CD8+ (cytotoxiques), qui ont été ensuite indexés pour différents sous-ensembles phénotypiques de lymphocytes T en utilisant les marqueurs CD45RA et CD62L. Les cellules T CD3+ ont également été analysées pour l’expression des marqueurs d’activation (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Stratégie de gating pour l’analyse cytométrique en flux. Des graphiques représentatifs d’un donneur de lymphocytes T activés avec des billes CD3/28 au jour 5 sont présentées (n = 4). Abréviations ; TEMRA = cellules mémoire effecteurs T réexprimant CD45RA ; TSCM = cellules T mémoire de type cellules souches ; TEM = cellules T à mémoire effecteur ; MTC = cellules T à mémoire centrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
Après l’activation avec les billes CD3/28, le pourcentage de cellules T CD4+ par rapport aux cellules T CD8+ a diminué au fil du temps, avec 74,3 % (± 7,4 %) des cellules T CD4+ au jour 5, qui est tombé à 14,6 % (± 3,4 %) au jour 20 après l’activation. Les lymphocytes T CD8+ sont passés de 20,7 % (± 6,4 %) au jour 5 à 82,4 % (± 3,1 %) au jour 20 (Figure 4A). Des tendances similaires ont été détectées après activation avec TransAct, avec des pourcentages légèrement plus faibles de cellules T CD8+ au jour 20 (72,5 % ± 0,7 %). Ainsi, l’expansion légèrement plus lente des cellules T observée après activation avec TransAct correspondait à un pourcentage plus faible de cellules CD8+ et un pourcentage plus élevé de cellules CD4+ durant la période d’expansion. Les différences dans la composition phénotypique des lymphocytes T étaient similaires pour les deux réactifs d’activation (Figure 4B). Cependant, les fréquences des cellules mémoire effecteurs T réexprimant CD45RA (TEMRA) étaient globalement plus élevées pour les cellules CD8+ que pour les cellules CD4+ . De manière concordante, les cellules T CD4+ présentaient des pourcentages plus élevés de cellules T à mémoire centrale (MTC) et de cellules T à mémoire de type cellules souches (TSCM) (Figure 4B).
CD134 était le seul marqueur d’activation déjà surélevé après le dégel des lymphocytes T, avec 37,6 % (± 4,1 %) des cellules T CD134+ activées avec des billes CD3/28 et 36,1 % (±4,4 %) des cellules T CD134+ pour les cellules T activées par TransAct (Figure 4C). Dans les deux stratégies d’activation, CD25, CD69 et CD134 étaient fortement augmentés au jour 2. Pour les billes CD3/28, l’expression CD69 et CD134 a atteint leur pic le jour 2, tandis que CD25 a atteint son pic au jour 5. Des résultats similaires ont été observés pour les lymphocytes T activés par TransAct. Les CD134 et CD154 n’ont été augmentés qu’au jour 14 pour les billes CD3/28 et les cellules activées par TransAct. Dans l’ensemble, les tendances observées étaient très similaires entre les deux réactifs d’activation. Cependant, l’expression de CD69 au jour 14 était légèrement plus élevée dans les lymphocytes T activés par CD3/28 que chez leurs homologues TransAct (97,1 % ± 0,9 % contre 86,5 % ± 5,1 %). Cela correspond au taux d’expansion élevé et prolongé observé avec les cellules activées par billes CD3/28. En résumé, le panel proposé de marqueurs d’activation inclut des marqueurs qui sont augmentés à la fois au début et aux moments ultérieurs après l’activation, avec une sensibilité variable entre les différents marqueurs d’activation, mais globalement, des tendances similaires pour les deux réactifs d’activation.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Analyse de l’expression du phénotype des lymphocytes T et des marqueurs d’activation avec différents réactifs d’activation pendant une période de cultivation de 20 jours. (A) Pourcentages de cellules T CD4+/CD8+ lors de la culture après activation avec des billes CD3/28 (à gauche) ou TransAct (à droite). (B) Différenciation des cellules T après activation avec des billes CD3/28 (deux panneaux à gauche) ou TransAct (deux panneaux à droite), chacun pour les cellules CD4+ ou CD8+. Le phénotype a été évalué à l’aide des marqueurs CD45RA et CD62L. TEMRA : CD45RA+ CD62L-, TEM : CD45RA- CD62L-, TCM : CD45RA-CD62L+, TSCM : CD45RA+ CD62L+. (C) Expression des marqueurs d’activation après activation avec des billes CD3/28 ou TransAct et pendant la période d’expansion. Les fréquences [ %] de la population parente des cellules T CD3+ sont indiquées (moyenne ± écart-type de 4 [billes CD3/28] ou 3 donneurs de cellules T saines différents). Abréviations ; TEMRA = cellules mémoire effecteurs T réexprimant CD45RA ; TSCM = cellules T mémoire de type cellules souches ; TEM = cellules T à mémoire effecteur ; MTC = cellules T à mémoire centrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>
Transfection transitoire des lymphocytes T primaires et analyse de l’expression de la CAR Les lymphocytes T primaires ont été transfectés avec l’ARNm par électroporation au jour 7 après l’activation avec des billes CD3/28 ou TransAct. Comme modèle, un codage d’ARNm pour un CAR de seconde génération ciblant le protéoglycane 4 du sulfate de chondroïtine (CSPG4) avec un co-stimulateur CD28 et un domaine de signalisation CD3ζ a été utilisé. Une étiquette DYKDDDDK (étiquette drape) a été incluse pour permettre la détection cytométrique en flux. La viabilité des cellules T et l’expression de la CAR ont été évaluées 3, 6, 24 et 48 heures après l’électroporation. La coloration a été réalisée comme décrit dans la section 6 du protocole.
Bien que la viabilité des lymphocytes T activés par billes CD3/28 et activées par TransAct soit restée faible 3 h après l’électroporation, globalement, la viabilité des cellules CAR T transfectées variait entre 51 et 85 % et ne différait pas significativement entre les deux stratégies d’activation (Figure 5A). Le CAR était déjà détectable à ce stade précoce après l’électroporation. Bien que le pourcentage de cellules CAR+ ait progressivement diminué au fil du temps, la fréquence la plus élevée de cellules CAR+ était détectable dans les 24 heures suivant l’électroporation (Figure 5B, panneau de gauche). Notamment, l’intensité du signal est restée stable dans les 6 premières heures après l’électroporation et a progressivement diminué par la suite (Figure 5B, panneau de droite). L’expression de la CAR était presque absente après 48 heures, démontrant la nature transitoire de la manipulation cellulaire et l’importance de choisir une fenêtre temporelle précoce pour les essais en aval. Des graphiques représentatifs pour l’expression CAR d’un donneur sont présentés à la Figure 5C. Pour les deux réactifs d’activation, le rapport CD4/CD8 ne différait pas entre les cellules CAR et les cellules transfectées par MOCK (Figure 5D). Conformément à nos résultats précédents, les lymphocytes T activés avec les billes CD3/28 montraient une fréquence légèrement plus élevée de cellules T CD8+ que celles activées avec TransAct. Pour l’analyse phénotypique, un donneur représentatif est indiqué en raison de grandes variations dépendantes du donneur (Figure 5E). Bien que le réactif d’activation et l’état CD4/CD8 influencent tous deux le phénotype des cellules T, l’expression de CAR ne provoque pas de changement de phénotype par rapport aux cellules transfectées par MOCK.
Pour évaluer l’influence de la concentration d’ARNm sur les niveaux d’expression, des lymphocytes T primaires ont été transfectés avec un ARNm codant pour une version mutante de GFP (muGFP) en utilisant 0,1, 0,3, 1, 3 ou 6 μg d’ARNm. Le signal GFP a été mesuré par cytométrie en flux 24 heures après l’électroporation. Comme prévu, des quantités déjà aussi faibles d’ARNm que 0,1 μg ont conduit à un signal détectable de GFP, avec une augmentation progressive de l’intensité du signal à mesure que les quantités d’ARNm augmentent. Dans nos expériences, 1 μg d’ARNm était déjà saturé, et des quantités plus importantes (3 et 6 μg d’ARNm) n’ont pas conduit à une augmentation du signal GFP (Figure 5F). Cela met en lumière la possibilité d’utiliser différentes quantités d’ARNm pour titrer les niveaux d’expression, ce qui peut être bénéfique pour tester l’influence de différents niveaux d’expression antigénique cible(28).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5 : Cinétique d’expression des CAR et analyse phénotypique des lymphocytes CAR T transfectés. (A) Viabilité des lymphocytes T CAR après électroporation avec un ARNm codant pour CAR. 2 μL de 7-AAD dans 100 μL de tampon de coloration ont été utilisés pour évaluer la viabilité après 10 minutes d’incubation. n = 2-3 donneurs individuels (B) Coloration pour l’expression de CAR avec un anticorps anti-DYKDDDDK (conjugué avec APC, dilution finale 1:50). Après la mise en orbite sur les cellules viables, on a analysé soit le pourcentage de cellules CAR-positives par rapport aux témoins transfectés par MOCK (panneau de gauche), soit l’intensité médiane géométrique de fluorescence (GeoMean, panneau de droite) de l’ensemble de la population. Sont présentées des moyennes de n = 3 donneurs individuels ± S.D. (C) Des graphiques représentatifs d’un donneur issus de (B) démontrant la cinétique de l’expression de la CAR au fil du temps. (D) Analyse des lymphocytes T CD4+/CD8+ et comparaison des lymphocytes T transfectés par MOCK avec des lymphocytes T transfectés par CAR, ainsi que deux stratégies d’activation différentes 24 heures après l’électroporation. Sont présentées des moyennes de n = 3 donneurs individuels ± S.D. (E) Analyse phénotypique des lymphocytes T transfectés par MOCK et CAR transfectés en (B) 24 h après l’électroporation. On le montre : un donneur représentatif de n = 3. (F) Analyse de l’expression de muGFP 24 heures après l’électroporation avec différentes quantités d’ARNm. La vérification de la grille pour les cellules vivantes a été réalisée avant que la GeoMoyenne pour la GFP ne soit quantifiée. Sont présentées des moyennes de n = 3 donneurs ± abréviations S.D. ; CAR = récepteur antigénique chimérique ; ARNm = acide ribonucléique messager ; 7-AAD = 7-aminoactinomycine ; RT = température ambiante ; muGFP = protéine fluorescente verte mutante ; S.D. = écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.</a>

Isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour générer les lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR)

To assess the efficacy and potency of chimeric antigen receptor (CAR) T cells, it is essential to isolate, activate, expand, characterize, and genetically ...

isolation-cultivation-transient-transfection-primary-human-t-cells-to

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique de fabrication ex vivo de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR). Les lymphocytes T humains sont incubés avec des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28, ainsi qu’un milieu complété par l’interleukine-2 (IL-2), conduisant à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T. Des vecteurs lentiviraux transgéniques sont introduits, ce qui permet à l’ARN transgénique de s’intégrer dans le génome de l’hôte et d’exprimer...

Une technique ex vivo pour fabriquer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique

Cette vidéo présente une technique de génération ex vivo de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifique de l’antigène tumoral. Des vecteurs rétroviraux porteurs d’ARN transgénique sont mélangés à des cellules de la rate dans un milieu complété par de l’interleukine-2 pour favoriser la survie et la prolifération des lymphocytes T. Le mélange est ensuite transféré sur une plaque recouverte de fragments de fibronectine humaine recombinante et centrifugée pour faciliter la...

Une technique ex vivo pour générer des lymphocytes T récepteurs antigéniques chimériques spécifiques à une tumeur

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’antigène par transduction rétrovirale. Des lymphocytes T CD8+ murins activés sont ajoutés à une plaque de micropuits recouverte de fragments de fibronectine recombinante. Des vecteurs rétroviraux contenant de l’ARN transgénique codant pour un récepteur d’antigène chimérique (CAR) spécifique de l’antigène sont ensuite introduits, et la plaque est centrifugée pour...

Technique de génération de cellules CAR-T spécifiques de l’antigène

Nous décrivons une approche pour générer fiable des cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) et testons leur différenciation et fonction in vitro et in vivo.

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Cet article détaille le processus de fabrication des lymphocytes T à récepteurs antigéniques chimériques à usage clinique, en particulier à l’aide d’un processeur cellulaire automatisé capable d’effectuer la transduction virale et la culture de lymphocytes T. Nous formulons des recommandations et décrivons les pièges à éviter qui doivent être pris en compte lors de l’élaboration du processus et de la mise en œuvre d’un essai clinique de phase précoce.

Fabrication de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique sur un processeur cellulaire automatisé

Ce protocole rationalise la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T murins, facilitant ainsi la génération efficace de cellules CAR-T chez la souris.

Génération efficace de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) murin

Ce protocole fournit un flux de travail rationalisé pour générer et tester des cellules T régulatrices du récepteur antigénique chimérique humain (CAR Tregs).

Génération de lymphocytes T régulateurs du récepteur de l’antigène chimérique humain

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour générer des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR) transitoires à l’aide d’ARNm non intégrateurs pour l’immunothérapie du cancer et fournit des méthodes fiables pour évaluer les cellules CAR-T et leur fonction cytotoxique.

Une approche non virale pour générer des lymphocytes T récepteurs antigéniques chimériques transitoires à l’aide de l’ARNm pour l’immunothérapie du cancer

Ici, nous décrivons une méthode de création de gouttelettes à double émulsion encapsulant un lymphocyte T et une cellule cible cancéreuse afin d’examiner la destruction cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet une double quantification des molécules cytotoxiques et de l’apoptose des cellules cibles au sein d’une large population de lymphocytes T.

Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Découvrez l'isolement, la culture et la transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour la recherche sur les cellules CAR. Ce protocole permet une ingénierie efficace et reproductible pour l'immunothérapie.

Isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour générer les lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR) (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour générer les lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR)

Explorer plus de vidéos